Par3蛋白和p-STAT3蛋白在宫颈病变组织中的表达及临床意义

郭春凤，郭文涛，马俊旗

(新疆医科大学1第一附属医院妇科,2基础医学院病理学教研室,乌鲁木齐 830011)

宫颈癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，死亡率位居第2位，严重危害女性健康，给社会及家庭带来沉重经济负担。复发以及中晚期转移为其主要死亡原因[1]。研究证实，极性蛋白复合物Par3-Par6-aPK在上皮肿瘤发生以及肿瘤侵袭转移中扮演重要角色，极性蛋白Par3 (partitioning defective protein 3,Par3)主要承担上皮细胞的紧密连接和细胞极性的维持作用。诸多研究发现极性蛋白Par3低表达，会诱导肿瘤发生，包括肿瘤的侵袭转移。研究发现Par3蛋白在乳腺癌、胰腺癌和原发性食管癌中表达低；其表达与肿瘤的组织学分化、淋巴结转移以及总生存期密切相关[2-4]。人体细胞内有许多信号转导通路，JAK/STAT3是最为重要的通路之一。磷酸化酪氨酸激酶(p-JAK)和磷酸化信号转导蛋白转录激活因3 (p-STAT3)蛋白在宫颈鳞癌组织中高表达，明显较癌旁的正常组织高[5-6]。本研究通过测定Par3和p-STAT3蛋白在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变II-III(CINII-III)、宫颈鳞状细胞癌(CSCC)和转移淋巴结组织中的表达差异，分析其与宫颈鳞癌的临床病理参数的关系，为宫颈癌靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取新疆医科大学第一附属医院宫颈疾病患者标本，包括14例慢性宫颈炎，36例CINII-III，43例CSCC中7例CSCC患者淋巴结转移组织，合计100例。其中宫颈癌中≤IB16例，>IIA27例；高分化鳞癌7例，中低分化鳞癌36例；淋巴结转移7例，未转移36例。组织标本均经两位病理科医师确诊。

1.2 抗体和试剂SP试剂盒和DAB显色剂购自北京中杉金桥公司。鼠抗人Par3抗体(1:300稀释，美国Santa Cruz公司)。兔抗人p-STAT3单抗(1:300稀释，美国Santa Cruz公司)。

1.3 方法

1.3.1 Par3和p-STAT3蛋白的检测 采用免疫组化SP法，切片经过常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后用微波炉进行抗原修复(中火10 min,中高火5 min)，然后滴加H2O2，目的是阻断内源性过氧化物酶作用，置于室温下孵育30 min；加入一抗放置于4℃冰箱。第2天再滴加二抗室温孵育40 min，DAB显色，苏木素复染以后常规脱水，最后封片。

1.3.2 结果判断 选择本院两位高年资病理科副主任医师，免疫组织化学结果的判读均双盲进行，将阳性细胞数和染色程度的比例作为判读标准。在光学显微镜下观察全视野的细胞，并且计数阳性细胞数所占上皮细胞的比例。根据所占比例判读计分，染色细胞计数<全视野5%计分为0分；5%～25%计1分，26%～75%视为2分；>75%者则计3分。判断染色强度方法：无显色或显色不清判为0分，浅黄色的计1分，棕黄色为2分，深棕色染色最强计3分。最后计算综合积分=(染色细胞分数+染色强度分数)/2。结果综合判定：<0.5分为表达缺失，0.5～1.5分为表达下调，>1.6分为正常表达[7]。

1.4 统计学方法各组数据应用SPSS 17.0软件进行统计学处理，资料分析采用χ2检验和Fisher精确概率法。相关分析采用Pearson相关，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Par3和p-STAT3蛋白在慢性宫颈炎、CIN、CSCC以及转移淋巴结组织中的表达免疫组织化学检测结果提示，细胞质是Par3蛋白的主要阳性表达部位，阳性细胞表现为染色黄色或棕黄色(图1)。Par3在慢性宫颈炎中阳性表达率最高，在CIN II-III和宫颈癌组织以及淋巴结转移灶中表达率逐渐下降，甚至缺失。上述4种组织中阳性表达率分别是100%(14/14)、97.2%(35/36)、62.8%(27/43)。随着宫颈病变加重，其蛋白表达量呈现逐渐降低趋势，各组间差异有统计学意义(P<0.05),见表1。P-STAT3主要阳性表达部位在细胞质和细胞核中，p-STAT3在CINII-III、CSCC和淋巴结转移灶中的阳性表达率分别为：69.4%(25/36)、60.4%(26/43)、42.9%(3/7)，显著高于慢性宫颈炎中的表达 35.7% (5/14)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 宫颈病变组织中Par3和p-STAT3蛋白阳性表达与临床病理参数的关系宫颈鳞癌组中Par3和p-STAT3蛋白表达量与临床病理参数关联性分析显示，Par3的阳性表达率与宫颈鳞癌的组织学分化以及淋巴结转移有关，差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈鳞癌组织中p-STAT3阳性表达与临床分期和组织学分化程度有关，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。Pearson相关性后结果显示，CIN II-III组织Par3与p-STAT3表达呈负相关(r=-5.553，P<0.05)。在CSCC组织中Par3与p-STAT3表达无相关性(r=2.118，P>0.05)，见表2。

表1 正常宫颈、CINII-III、宫颈癌、淋巴结组织Par3及p-STAT3蛋白阳性表达与临床病理参数的关系/例(%)

表2 CINII-III、CSCC组织中Par3及p-STAT3蛋白表达水平的相关性分析/例

注:a～c:Par3蛋白分别在慢性宫颈炎、CIN II-III和CSCC中的表达；d～f:p-STAT3蛋白分别在慢性宫颈炎、CIN和CSCC中的表达。图1 Par3及p-STAT3蛋白在宫颈病变组织中表达(×200)

3 讨论

上皮细胞的极性缺失被认为是肿瘤侵袭和转移的重要标志[8-9]。Par3被看作一种多结构的支架蛋白，在上皮细胞的紧密连接以及其极性的维持方面，起到了至关重要的作用。Par3通过与衔接蛋白Par6结合，将aPKC递送至细胞表面从而维持上皮细胞间紧密连接[10-11]。此外，该复合体不仅涉及细胞间极性的形成，还参与细胞增殖，迁移和细胞分裂，并对多种信号转导蛋白的调节起到重要的作用。研究表明，上皮-间质转化(EMT)和肿瘤侵袭转移与Par3表达缺失有关。STAT3是多种生理功能的关键调节因子，主要作用于细胞增殖、凋亡、迁移等方面，在免疫反应方面也有重要的功能。

一项Par3 蛋白影响体外培养子宫颈癌 Si Ha 细胞生物学性状的研究发现，Par3 过表达后降低了细胞的侵袭迁移能力，而干扰组蛋白表达下调增强了细胞侵袭、迁移能力，提示Par3蛋白参与子宫颈癌 Si Ha 细胞的增殖、迁移、侵袭等过程，PARD基因的异常低表达与宫颈鳞癌的发生、发展甚至侵袭、转移有促进作用[12]。Jan等[13]的有关原发性肝癌的报道显示，Par3表达率为42.3%，其表达与肝癌的淋巴结转移和远处转移成正相关，与肿瘤分期、肿瘤大小无关，而且Par3表达升高不利于患者的生存预后。Guyer等[14]的研究发现，下调Par3表达后，肝癌细胞的迁移能力则显著下降。同样在卵巢癌和皮肤癌中，Par3表达水平明显升高，发挥原癌基因的角色[15-16]。在本研究中Par3蛋白在慢性宫颈炎组织、CINII-III、CSCC以及淋巴结转移灶中的阳性表达率逐渐降低。提示可以将Par3蛋白表达下调视为细胞发生恶性变的早期预警信号。Par3的阳性表达率与肿瘤的组织学分化及淋巴结转移有关。Par3蛋白可能是作为宫颈鳞癌的抑制因子参与疾病进展，因其与宫颈鳞癌组织学分化以及淋巴结转移有关，亦可将其看作宫颈鳞癌术后不良预后的一个重要因素。

已有研究利用测定p-STAT3和p-JAK表达，协助判断JAK2/STAT3信号通路的活化状态，预测肿瘤病情及预后。一项有关宫颈癌干细胞生物学特性调控的研究得出，与空质粒组及STAT3低表达组相比，高表达组肿瘤的形成高于其他2组，且JAK/STAT3通路持续活化，促进宫颈鳞癌的进展[17]。谭豆豆等[18]的研究发现食管鳞癌组织中p-JAK2阳性表达率明显高于癌旁阴性组织(P<0.05)，并且p-JAK2阳性率随着分化程度随着肿瘤恶性程度的升高而降低，提示在食管癌发生早期，p-JAK2磷酸化水平较高，以此来激活p-JAK2/STAT3信号通路参与食管癌的进展。

与慢性宫颈炎相比，CINII-III和CSCC中p-STAT3蛋白表达显著上调，在淋巴结转移灶中p-STAT3表达率为100%。提示p-STAT3蛋白高达与宫颈鳞状细胞癌发生、肿瘤进展有关。分析Par3和p-STAT3蛋白表达与宫颈癌临床病理参数之间关系，发现Par3的阳性表达与宫颈鳞癌的组织分化程度以及淋巴结转移有关，p-STAT3表达与临床分期及组织分化程度具有关，进一步对CINII-III和CSCC中Par3蛋白与p-STAT3蛋白的表达进行相关性分析显示，在CINII-III组中两者之间呈负相关，而在CSCC中两者之间无相关性。提示宫颈癌前病变中Par3蛋白低表达，促进JAK2/STAT3信号通道异常活化，调控下游基因促进细胞异常增生甚至肿瘤形成，但其调控机制尚需进一步探究。CIN II-III组织中 Par3蛋白低表达、p-STAT3高表达，可作为宫颈上皮内瘤变的预警指标。二者对宫颈高级别病变、宫颈鳞癌发生的启动有重要意义，其作用机制需进一步探究。可以通过干预Par3蛋白与p-STAT3蛋白的表达预防和治疗宫颈上皮内瘤变甚至宫颈鳞癌。CSCC组织中Par3蛋白与p-STAT3蛋白表达的相关性分析则显示无相关性。考虑是否与样本量小有关。将在后期扩大样本量探究二者在宫颈鳞癌发生、发展的调控机制。

综上所述，本研究发现在宫颈鳞癌组织中Par3蛋白低表达，p-STAT3蛋白高表达，并且在CINII-III中两者之间呈负相关，推测Par3和p-STAT3蛋白与宫颈高级别上皮内瘤变有关。而宫颈高级别上皮内瘤变是进展为宫颈鳞癌的连续病理的癌前病变,推测Par3和p-STAT3蛋白对宫颈鳞癌的启动具有重要意义，也可作为二者的预警指标。本次研究的局限性在于组织水平检测Par3蛋白、p-STAT3蛋白的表达情况及其相关性，后期会深入研究Par3蛋白激活JAK/STAT3 通路的分子机制，以期为宫颈癌的病理诊断及靶向治疗提供新的分子靶点。