一株单宁降解菌的鉴定及其对青海“双低”菜籽粕中单宁降解效果

丁 栋 李锦丽 李长忠 雷占静 杨丰年

(青海大学生态环境工程学院1，西宁 810016) (中国科学院盐湖资源综合高效利用重点实验室；青海省盐湖资源化学重点实验室2，西宁 810008)

当饲料中菜籽粕含量过高时，菜籽粕中以单宁为主的抗营养因子会产生影响适口性、在动物肠胃中产生不溶性化合物、导致肠胃中消化酶活性丧失、因沉淀作用降低矿物元素利用率等负面影响，造成动物生长及饲料利用率显著下降，从而增加饲料投入成本[1-2]。研究有效的菜籽粕中单宁的处理方法，对于合理利用 “双低”菜籽粕饲料原料具有重要的研究价值及意义。

针对植物性饲料中单宁的处理方法主要包括物理处理法、化学处理法及生物处理法。其中生物处理是经济、环保的处理方法之一。当前，对单宁生物处理研究内容主要包括两个方面：一方面，自土壤、植物、食品、废水、食物材料加工设备及废水处理设备等特殊生境，针对水解单宁的酯键及羧酸键，筛选高效单宁降解菌，如Escherichiacoli，AspergillusnigerHA37，Paecilomycesvarioti[3-4]。另一方面，以单宁降解菌为基础，优化单宁降解体系，包括：单宁降解菌产生优质单宁酶的筛选及结构鉴定，单宁酶固定化处理，产单宁酶微生物发酵培养体系优化及优质单宁酶的生物合成等[5-8]。

微生物固态发酵法是简易有效的单宁降解方法之一，相关微生物资源的筛选是该方法的核心研究内容。研究表明，青海典型生境中微生物资源具有特殊的研究意义及价值[9]，但是与该地区单宁降解菌相关的研究内容鲜见报道。因此，筛选青海典型生境中有效单宁降解菌资源，不仅扩充相关菌种资源库，也为青海典型生境中微生物资源的应用提供参考。同时，青海具有典型高原大陆性气候，作物病虫害少，耕地土壤污染小等特点，现已成为北方春油菜及南方弱冬性油菜种植区繁种、制种的重要基地，油菜种植面积及产量逐年增加[10-11]。青海“双低”菜籽粕是青海省研发的“双低”油菜籽加工后生成的农副产品，其蛋白、矿物元素及微量元素含量高，成本投入低，是具有开发价值的饲料原材料。

本实验对青海地区可培养单宁降解菌资源进行筛选及鉴定，并以青海“双低”菜籽粕为研究对象，进行固态发酵处理应用研究，以期为青海地区微生物资源应用提供科学数据，同时也为有效处理“双低”菜籽粕中单宁，合理利用青海“双低”菜籽粕提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

土壤样品采集时间为2018年7月，采样点位于青海省门源县(E101°29′51″, N37°22′51.7″, 海拔2 867 m)。根据样地植被覆盖度及多样性评估结果，将样地分为高、中、低三等级。针对三种等级植被样地，采用样方采样法(样方面积为1 m×1 m)，采集样方边角及中心0～20 cm土层样品，分装入无菌自封袋中备用。

1.2 土壤样品预处理

称取土壤样品10 g，室温风干。取风干土样于无菌研钵中，去除植物根系等杂质，烘箱100 ℃条件处理20 min。称取1 g处理土壤样品于100 mL无菌蒸馏水中，135 rpm/min、27 ℃条件下振荡处理30 min，土壤悬液静置备用。

1.3 菌种的分离、纯化、筛选及鉴定

1.3.1 培养基

菌种分离培养基为黄豆培养基：黄豆粉1.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，K2HPO40.1 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.03 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，ZnSO40.002 g，琼脂1.5 g，H2O 100 mL，pH 7.2～7.4；菌种筛选培养基：蛋白胨1 g，牛肉膏0.3 g，NaCl 0.5 g，1%单宁(0.22 μm滤器过滤除菌)，琼脂1.5 g，H2O 100 mL，pH 7.0。

1.3.2 菌种分离、纯化及筛选

梯度稀释法[12]处理土壤悬液。吸取10-3稀释液10 μL至黄豆平板培养基表面，涂布平板法[12]处理菌液，27 ℃恒温倒置培养，平板划线法[21]纯化培养菌体。纯化菌种选择菌种筛选培养基通过平板筛选法筛选[13]。

1.3.3 菌种扫描电镜检测

液体发酵目标菌种100 mL，无菌水清洗菌体，3 000 r/min离心5 min收集菌体沉淀。菌体沉淀中加入40倍体积2.5%戊二醛，混匀后静置固定2 h。无菌水清洗固定菌株，分别加入30%、50%、70%、80%及90%乙醇静置脱水10 min，3 000 r/min离心5 min收集菌体沉淀，无菌水重悬菌体。吸取适量处理菌液置于装片台上，37 ℃烘干处理，JSM-5610LV扫描电镜检测。

1.3.4 菌种鉴定

菌种生理生化特征检测参照《伯杰细菌系统鉴定手册》(第9版)及《常见细菌系统鉴定手册》[14-15]。菌株16S rRNA扩增选用EmeraldAmpTMPCR Master Mix Kit(Sangon Biotech，Shanghai)，扩增引物为27F(5’-AGAGTTTGATC (A/C)T G G C T C AG-3’)及1492R(5’-TAC G G (C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，反应30个循环；72 ℃再延伸10 min。选用DiaSpin DNA Gel Extraction Kit(Sangon Biotech，Shanghai)回收扩增产物，通过pUCm-T Vector PCR Products Cloning Kit(Sangon Biotech，Shanghai)构建16S rRNA基因克隆文库，筛选阳性克隆子10株送至生工生物工程上海有限公司测序。DNAMAN 9.0处理测定克隆子序列，处理结果通过NCBI数据库 Blast比对，并用Clustal W以及MEGA 7.0软件中邻接法构建与序列相似菌种16S rRNA系统发育树[16]。

1.4 菌种固态发酵处理青海“双低”菜籽粕作用效果研究

1.4.1 单宁标准曲线制作

选用FeCl3显色法构建单宁标准曲线。显色剂配制：0.01 mol/L FeCl3溶液溶解于0.01 mol/L HCl中备用。单宁标准液配制：无菌蒸馏水溶解单宁，终浓度定容至1%(g/100 mL)，选用0.22 μm滤器过滤单宁溶液除菌备用。单宁标准曲线制作：反应液总体积为6 mL，分别取已配制单宁液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，室温条件下与显色剂反应30 min，测定吸光值(A530 nm)，实验重复3次。最终以单宁液体积为横坐标，吸光值(A530 nm)为纵坐标，构建单宁标准曲线。

1.4.2 料液比对固态发酵处理效果的影响研究

60目筛网筛选青海“双低”菜籽粕5 g，高温高压灭菌处理备用。目标菌种液体发酵至浓度为108个/mL，接种发酵液1 mL至含水量为50%、100%、150%、200%、250%菜籽粕固态培养基中，以接种1 mL无菌水菜籽粕固态培养基为空白对照，室温发酵处理5 d。样品发酵后，冻干处理并用1 mL无菌水溶解，0.45 μm滤器过滤，FeCl3显色法检测单宁含量，每一处理设立平行实验5次。

1.4.3 温度对固态发酵处理效果的影响研究

菜籽粕筛选及处理同1.4.2。目标菌种液体发酵至浓度为108个/mL，接种发酵液1 mL至100%料液比菜籽粕固态培养基中，以接种1 mL无菌水菜籽粕固态培养基为空白对照，以15、25、35、45、55 ℃温度条件发酵处理5 d。发酵结果处理同1.4.2。

1.4.4 时间对固态发酵处理效果的影响研究

菜籽粕筛选及处理同1.4.2。目标菌种液体发酵至浓度为108个/mL，接种发酵液1 mL至100%料液比菜籽粕固态培养基中，以接种1 mL无菌水菜籽粕固态培养基为空白对照，在室温条件下分别发酵处理1、2、3、4、5 d。发酵结果处理同1.4.2。

1.4.5 数据处理

结合单宁标准曲线，计算不同实验处理单宁降解率，SPSS 22.0完成差异显著性分析(P<0.05)，Graphpad prism 5.0制图。单宁降解率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 单宁降解菌DT-3的形态特征

研究采用梯度稀释法自青海门源高寒草甸土壤分离菌种，根据菌种颜色、形态及大小等表观特征对初步分离菌群进行纯化，最终获得单菌落菌株123株。通过平板筛选法筛选到单宁降解菌1株，初步命名为DT-3。菌落在分离培养基表面特征为直径2 mm，表面形态呈黄色、圆形、凸起、不透明、光滑湿润且边缘整齐，在筛选培养基上呈现棕绿色水解圈(图1a、图1b)。扫描电镜显示菌株为杆状，无鞭毛或其他细胞外结构，长度4 μm(图1c)。

图1 DT-3的水解及菌体特征图

2.2 单宁降解菌DT-3的生理生化特征

对单宁降解菌DT-3生化特征及碳水化合物发酵等24项内容进行检测，结果表明菌种DT-3在柠檬酸盐利用、硝酸盐还原反应、脲酶检测及β-半乳糖甘酶活性检测中呈阳性，对葡萄糖利用呈阳性(表1)。

表1 菌种DT-3生化特征及碳水化合物发酵检测

注:“+”表示实验结果为阳性；“-”表示实验结果为阴性。

2.3 单宁降解菌DT-3 16S rRNA鉴定

菌种DT-3采用液氮冻融法提取总DNA，PCR扩增获得大小约1 500 bp 16S rRNA基因序列。构建目的基因克隆文库，随机挑选阳性克隆子10株完成序列测定。测序结果通过DNAMAN 9.0进行多重序列间比对，一致性等于99.8%，表明扩增基因纯度及测序结果良好。NCBI比对基因序列，结果与菌种Pseudoxanthomonasdaejeonensis序列相似性达97%，结合形态及电镜特征，最终将菌种DT-3命名为Pseudoxanthomonassp. DT-3。测定序列提交至NCBI GenBank，获取基因序列号MK 418539(图2)。

图2 根据邻接法构建DT-3 16S rRNA基因序列系统发育树

2.4 菌种DT-3固态发酵处理青海“双低”菜籽粕作用效果研究

2.4.1 单宁标准曲线构建

选用FeCl3显色法构建单宁标准曲线。以相同浓度、不同体积单宁液为横坐标，吸光值(A530 nm)为纵坐标，通过Graphpad prism 5.0软件构建单宁标准曲线图。最终构建标准曲线线性回归方程为Y=0.007 7X+0.010 7(R2=0.992 6)。依照单宁标准曲线(图3a)及降解率公式计算处理后单宁含量及降解率。

2.4.2 料液比对固态发酵处理效果的影响

通过SPSS 22.0对不同料液比处理条件下单宁降解效果进行差异显著性分析(P<0.05)，研究结果表明(表2，图3b)：对60目过筛处理菜籽粕，经固态发酵5 d，菌种DT-3对含水量分别为50%、100%、150%、200%、250%菜籽粕中单宁的降解效果差异显著。不同含水量处理条件，降解率由高到低排序为100%>150%>200%>250%>50%。含水量为100%时，菜籽粕中单宁降解率最大，为58.8%，与其他处理条件相比差异极显著。含水量为50%时，菜籽粕中单宁降解率最小，为37.41%，相比含水量250%处理条件降解效果差异显著，与其他处理条件相比差异极显著。

2.4.3 发酵温度对固态发酵处理效果的影响

通过SPSS 22.0对不同发酵温度处理条件下单宁降解效果进行差异显著性分析(P<0.05)，研究结果表明(表2、图3c)：对60目过筛处理菜籽粕，料液比为100%，菌种DT-3在发酵温度分别为15、25、35、45、55 ℃条件下，固态发酵处理5 d后，菜籽粕中单宁降解效果差异显著。不同发酵温度，降解率由高到低排序为25>35>45>15>55 ℃。发酵温度为25 ℃时，菜籽粕中单宁降解率最大，为62.95%，与其他处理条件相比差异极显著。发酵温度为55 ℃时，菜籽粕中单宁降解率最小，为0.17%，相比15 ℃处理效果差异显著，与其他处理条件相比差异极显著。

2.4.4 发酵时间对固态发酵处理效果的影响

通过SPSS 22.0对不同发酵时间处理条件下单宁降解效果进行差异显著性分析(P<0.05)，研究结果表明(表2，图3d)：根据降解率高低，菌种DT-3对60目过筛处理菜籽粕，料液比为100%，不同发酵时间降解率依次为5>4>3>2>1 d。其中固态发酵菜籽粕5 d时，降解率最高，为61.74%，相比发酵4 d的处理效果差异不显著，但与其他发酵处理时间降解效果相比差异极显著。发酵处理1 d时，菜籽粕中单宁降解率最小，为38.81%，相比其他条件处理效果差异极显著。发酵处理3 d及4 d时，降解效果差异显著。

图3 单宁标准曲线(A)及不同条件下DT-3发酵处理效果(B、C、D)

处理因素处理条件单宁含量(平均值±标准误)/mg/mL降解率/%显著性∗α=0.05α=0.01505.67±0.0437.41aA1003.73±0.0258.80eD料液比 /%1503.96±0.0456.26dC2004.75±0.0447.56cB2505.54±0.0738.81bA

续表2

注:标记字母说明显著性分析结果。

3 讨论

生物脱毒法是去除饲料中抗营养因子经济环保的处理方法之一，其处理方式包括添加酶制剂法及微生物发酵法，即向饲料中添加外在酶系或微生物，经发酵处理，去除饲料中的抗营养因子。相比而言，添加酶制剂法要求较高，影响处理效果的因素较多，如酶活性、酶的稳定性、最优酶活性条件、酶的固定处理等。而微生物发酵法要求较低，影响因素较少，如微生物对饲料主要营养成分有无吸收利用，菌种有无毒性代谢物生成，菌种是否影响饲料适口性等，因此微生物发酵法较为简易。

筛选微生物资源是微生物发酵法的核心内容。当前，针对单宁降解菌筛选及降解效果的研究内容广泛，筛选出单宁降解特性的菌种包括Penicilliumpurpurogenum、Paecilomycesvarioti、Aspergillusheteromorphus、Streptomycessviceus、Aspergillusniger等[17-21]。针对普通“双低”菜籽粕单宁降解效果研究，以黑曲霉降解效果最佳，降解率达到90%[22]。青海独特的生态环境赋予该地区微生物资源以特殊的研究意义及价值，目前针对该地区抗营养因子降解菌的筛选研究鲜见报道。本研究自青海门源高寒草甸生境中筛选到菌种123株，通过平板法筛选到单宁降解菌1株，通过形态特征、生理生化检测及16S rRNA序列测定，将该菌定名为Pseudoxanthomonassp. DT-3 (MK 418539)，菌种属于假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)。研究表明，假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)生物降解能力具有重要的研究价值：Giri等[23]自除草剂处理麦田中分离到一株异丙隆降解菌(Pseudoxanthomonassp.)，并对菌种的异丙隆降解效能进行研究，发现该菌种对异丙隆除草剂的降解效率达(165.73±0.59) mg L-1；Du等[24]自中国不同栖息地分离筛选产纤维素乙醇降解菌，并对菌种降解作用的重要性进行了研究，发现Pseudoxanthomonastaiwanensis在降解纤维素并产纤维素乙醇过程中扮演了主要角色；Wang等[25]自双氯苯基三氯乙烷(DDT)污染土壤中分离到一株DDT降解菌株，通过菌种鉴定将该菌株命名为Pseudoxanthomonasjiangsuensissp.nov.。本研究对青海门源高寒草甸土壤中分离得到的一株单宁降解菌Pseudoxanthomonassp. DT-3 (MK 418539)的特征及其单宁降解特性进行报道，研究结论为假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)的生物降解应用增加相关理论数据。

研究表明，饲料中单宁含量在主要成分中占比超过0.5%，即显著影响饲料蛋白质及矿物元素利用率[26-27]。青海“双低”菜籽粕中单宁含量约占主要成分0.52%，质量占比约为0.18%，鉴于此，本实验对“双低”菜籽粕进行DT-3固态发酵法处理单宁效果进行研究，60目过筛处理饲料，最适于微生物对饲料的发酵处理，因此选择60目过筛为饲料的初步处理条件。结合菌种生长特性，对不同发酵温度、料液比及发酵时间的降解效果进行了研究。结果表明料液比为100%、发酵温度为25 ℃、发酵天数为5 d时单宁降解率最大，分别达到58.8%、62.95%及61.74%，对青海“双低”菜籽粕中的单宁降解效果良好。研究结果也间接说明了菌种DT-3发酵处理过程中，保证微生物生长活性的最佳水活度、生长温度及生长时间。

4 结论

对青海地区单宁降解菌进行筛选、鉴定及固态发酵处理效果研究，为相关的研究方向提供了重要的基础数据。通过对菌种固态发酵条件优化处理，单宁降解率最高为62.95%，相比黑曲霉降解效果较低。今后将对DT-3中单宁降解基因的筛选与表达，DT-3代谢物及其对菜籽粕中营养物质的影响，发酵产品适口性等内容做进一步研究，从而为提高菌种DT-3单宁降解效率、开发相关菌种资源及其作为饲料添加剂的价值评估夯实理论基础。