天然抗氧化剂二氢杨梅素的提取工艺比较研究

郑琳 刘盼盼 王雪萍 高士伟 龚自明

摘要：以湖北省恩施州富硒土壤上生长的藤茶为原料，采用3种方法提取天然抗氧化剂二氢杨梅素（DMY）。结果显示，超声辅助提取条件下，料液比1∶70（g∶mL），用80%乙醇溶液常温提取50 min，提取液中DMY含量较高，为19.010%;微波辅助提取条件下，560 W功率，料液比1∶70（g∶mL），用60%乙醇溶液提取120 s，提取液中DMY含量较高，为18.174%;破壁式辅助提取条件下，常温25 ℃，料液比1∶50（g∶mL），用100%纯乙醇溶液提取5 min，提取液中DMY含量较高，为15.172%;三者相比较，各有优势，超声提取DMY含量较高，微波提取用时短，破壁式提取批次处理量大。

关键词：天然抗氧化剂;二氢杨梅素（DMY）;藤茶;提取工艺

中图分类号：R93         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）20-0137-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.033           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

The comparative study on extraction of natural antioxidant-dihydromyricetin

ZHENG Lin，LIU Pan-pan，WANG Xue-ping，GAO Shi-wei，GONG Zi-ming

（Fruit and Tea Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： Using Ampelopsis grossedentata which is growing on the soil（Enshi，Hubei Province） rich in selenium as material， the natural antioxidant dihydromyricetin （DMY） was extracted by three methods. The results showed that the optimum extraction process were the ratio of tea material to water 1∶70（g∶mL），50 min， 80% ethanol solution at room temperature under the condition of ultrasound assisted extraction，the content of DMY in tea soup was 19.010%. Under the condition of microwave assisted extraction， the optimum extraction process were 560 W power， the ratio of tea material to water 1∶70（g∶mL），120 s，60% ethanol solution， the content of DMY in tea soup was 18.174%. Under the condition of wall-breaking assisted extraction，the optimum extraction process were 50 min，the ratio of tea material to 100% pure ethanol solution 1∶50（g∶mL） at room temperature， the content of DMY in tea soup was 15.172%. Compared with the three methods， the ultrasonic extraction rate is high， the microwave extraction time is short， and the wall-breaking extraction batch processing is large.

Key words： natural antioxidant; DMY; Ampelopsis grossedentata; extraction process

藤茶系葡萄科蛇葡萄植物顯齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）的茎叶，是一种多年生的藤本植物。藤茶是目前所有被发现的植物中含黄酮最高的，故被称为“黄酮之王”。黄酮主要成分为二氢杨梅素（DMY），具有抑菌消炎、止咳化痰、降“三高”、抗癌等功能[1-6]，并且可以有效抗氧化[7-12]，近年来备受关注，有望作为一种天然无毒的抗氧化剂应用于食品生产中。本研究以湖北省恩施土家族自治州富硒土壤上生长的藤茶为原料，比较分析超声提取、微波提取和破壁式提取3种方法对DMY成分的提取效果，为工业化绿色高效提取DMY提供理论基础，并为提高藤茶利用率提供技术支持。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  藤茶原料  原料来自湖北省恩施州来凤县金藤子专业合作社。

1.1.2  试验试剂  乙醇为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），冰乙酸、乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司），二氢杨梅素（DMY）标准品（上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）。

1.2  试验方法

1.2.1  超声提取  单因素试验：超声提取时间选取20、30、40、50、60、70 min，乙醇体积分数选取0、20%、40%、60%、80%、100%，料液比选取1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g∶mL，下同），以此研究各因素对藤茶中DMY提取的影响。

正交试验：通过单因素试验分析各因素对DMY提取量的影响，确定较佳的单因素试验条件范围，在此基础上，以超声时间、乙醇体积分数、料液比为主要影响因素，各选出3个水平，进行L9（34）正交试验（表1）。

1.2.2  微波提取  单因素试验：微波提取时间选取30、60、90、120、150、180 s，乙醇体积分数选取0、20%、40%、60%、80%、100%，料液比选取1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，微波功率选取70、210、350、560、700 W，以此研究各因素对藤茶中DMY提取的影响。

正交试验：通过单因素试验分析各因素对DMY提取量的影响，确定较佳的单因素试验条件范围，在此基础上，以微波时间、乙醇体积分数、料液比、微波功率为主要影响因素，各选出3个水平，进行L9（34）正交试验（表2）。

1.2.3  破壁式提取  破壁式提取选用JHBE-50S闪式提取器，基于组织破碎原理将物料快速破碎至适当粒度，同时伴有高速搅拌、超强振动、负压渗滤等作用实现提取目的，最大限度保留植物有效成分不会受热破坏，溶剂用量小，提取时间短，效率高。

单因素试验：破壁式提取时间选取1、2、3、4、5、6 min，乙醇体积分数选取0、20%、40%、60%、80%、100%，料液比选取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，以此研究各因素对藤茶中DMY提取的影响。

正交试验：通过单因素试验分析各因素对DMY提取量的影响，确定较佳的单因素试验条件范围，在此基础上，以破壁时间、乙醇体积分数、料液比为主要影响因素，各选出3个水平，进行L9（34）正交试验（表3）。

1.3  高效液相色谱分析检测

色谱柱为Agilent TC-C18不锈钢柱（250 mm×4.6 mm）。流动相为甲醇-水（3∶7）（用冰乙酸调pH至3.5）。流速为0.7 mL/min，检测波长为292 nm，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。

标准曲线：准确称取20 mg DMY标准样品，溶解于上述流动相，精确定容至25.0 mL，得到0.8 mg/mL母液。然后取适量上述溶液，分别稀释至1、4、8、16、32倍，即得浓度梯度为0.800、0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL的标准溶液。将配制好的标准溶液用高效液相色谱法进行测定，以测定得到的色谱峰面积和已知标准溶液浓度进行回归分析，得回归分析曲线y=3×10-8x+0.012，R2=0.999，x为峰面积，y为样品浓度（mg/mL）。

2  结果与分析

2.1  超声提取

2.1.1  单因素试验结果  固-液提取过程分为3步[7]：①溶剂进入固体内部，溶质溶解;②溶质从固体内部到表面;③溶质溶解液从固体表面到溶剂中。图1表明，藤茶提取液中DMY含量随着时间的延长呈先升后降的趋势。分析其原因在这个时间范围内，随提取时间的延长，DMY浸出量增加，但当提取时间到达一定值后，DMY因氧化等原因发生结构变化，含量反而有所下降。

图2表明，80%乙醇对于藤茶中DMY的提取具有明显作用，提取液中DMY的含量随着乙醇体积分数的增加呈先升后降的趋势。

图3表明，在选取的料液比范围内随着溶剂的增加，提取液中DMY含量一直呈上升趨势，但当料液比达到1∶60后，再增加提取溶剂量，DMY含量反而略有下降。分析其原因为：藤茶粉中所含的DMY量是一定的，当提取溶剂到达一定量后，DMY已全部提取出，再增加溶剂量也没有明显增加，反而会因温度等原因加快DMY的氧化。

2.1.2  正交试验确定超声提取DMY的最佳条件  根据单因素试验结果，超声时间选取40、50、60 min，乙醇体积分数选取60%、80%、100%，料液比选取1∶50、1∶60、1∶70，正交分析结果见表4和表5。

由表4可见，提取二氢杨梅素含量最高的处理组合为A2B2C3，分析各因素k的变化率得到的最优处理组合为A1B2C3，但由表5可知，B因素对结果的影响显著，A因素和C因素对结果的影响不显著。综合表4和表5中的结果，并经试验验证，得到最佳可行的提取工艺组合为A2B2C3，即提取时间50 min，乙醇体积分数80%，料液比1∶70，在此条件下提取液中DMY含量为19.010%。

2.2  微波提取

2.2.1  单因素试验结果  图4表明，藤茶提取液中DMY含量随着提取时间的延长呈先升后降的趋势，提取时间为60 s时，DMY含量达到最高，随着提取时间继续延长，DMY因氧化等原因发生结构变化，含量反而有所下降。图5表明，藤茶提取液中DMY含量随乙醇体积分数的增加呈先升后降的趋势，乙醇体积分数为60%时DMY含量达到最大，随后缓慢下降。

图6表明，在选取的料液比范围内随着提取用水量的增加，藤茶提取液中DMY含量一直呈上升趋势，但当料液比达到1∶60后，再增加提取用水量，反而会因温度等原因加快DMY的结构转化，DMY含量降低。

图7表明，微波功率增大，藤茶提取液中DMY含量会随之提高，当达到560 W时，DMY含量达到最高，微波功率提高到700 W时，会因温度等原因破坏DMY成分，含量反而下降。

2.2.2  正交试验确定微波提取DMY的最佳条件  根据单因素试验结果，提取时间选取60、90、120 s，乙醇体积分数选取60%、80%、100%，料液比选取1∶50、1∶60、1∶70，微波功率选取350、560、700 W，正交分析结果见表6和表7。

由表6可知，从藤茶中提取DMY含量最高的处理组合为A3B1C3D2，分析各因素k的变化率得到的最优处理组合为A2B1C3D2，但由表7可知，A、C和D因素对结果的影响均不显著，只有B因素对结果的影响显著。综合表6和表7结果，并经试验验证，得到最佳可行的提取工艺组合为A3B1C3D2，即微波时间120 s，乙醇体积分数60%，料液比1∶70，微波功率560 W，在此条件下藤茶提取液中DMY含量为18.174%。

2.3  破壁式提取

2.3.1  单因素试验结果  图8表明，藤茶提取液中DMY含量随着破壁时间的延长呈先升后降的趋势，提取时间为5 min时，DMY含量达到最高，提取时间继续延长，DMY因氧化等原因发生结构变化，含量反而下降。

图9表明，藤茶提取液中DMY含量隨着乙醇体积分数的升高而增加，乙醇体积分数为80%和无水乙醇条件下，DMY含量相差不大。

图10表明，在选取的料液比范围内随着提取用水量的增加，藤茶提取液中DMY含量一直呈上升趋势，但当料液比达到1∶50后，再增加提取用水量，对DMY的浸出影响不大，反而会因温度等原因加快DMY的氧化，同时提高生产成本。

2.3.2  正交试验确定破壁式提取DMY的最佳条件  根据单因素试验结果，破壁时间选取3、4、5 min，乙醇体积分数选取60%、80%、100%，料液比选取1∶40、1∶50、1∶60，正交分析结果见表8和表9。

由表8可知，采用破壁式方法提取DMY，得到DMY含量最高的处理组合为A3B3C2，分析各因素k的变化率得到的最优处理组合为A3B2C2，但由表9可知，A因素对结果的影响显著，B因素和C因素对结果的影响不显著。综合表8和表9结果，通过试验验证，得到最佳可行提取工艺组合为A3B3C2，即破壁时间5 min，乙醇体积分数100%，料液比1∶50，在此条件下提取液中DMY含量为15.172%。

3  小结

超声辅助提取条件下，最佳提取工艺组合为超声时间50 min，乙醇体积分数80%，料液比1∶70，在此条件下提取液中DMY含量为19.010%。乙醇体积分数对提取液中DMY含量的影响显著，超声时间和料液比对提取液中DMY含量的影响不显著。

微波辅助提取条件下，最佳提取工艺组合为微波时间120 s，乙醇体积分数60%，料液比1∶70，微波功率560 W，在此条件下提取液中DMY含量为18.174%。乙醇体积分数对提取液中DMY含量的影响显著，微波时间、微波功率和料液比对提取液中DMY含量的影响均不显著。

破壁式辅助提取条件下，最佳提取工艺组合为破壁时间5 min，乙醇体积分数100%，料液比1∶50，在此条件下提取液中DMY含量为15.172%。破壁时间对提取液中DMY含量的影响显著，乙醇体积分数和料液比对提取液中DMY含量的影响不显著。

3种提取条件相比较，超声提取条件下提取液中DMY含量较高，但提取时间长，适用于提取较高含量、较高纯度的DMY;微波提取用时较短，但批次处理量小，适用于快速提取;破壁式提取条件批次处理量大，溶剂损耗较小，但是提取率较低，适用于工业化生产。

4  讨论

以湖北省恩施州富硒土壤上生长的藤茶为原料，比较分析了超声提取、微波提取和破壁式提取3种方法对二氢杨梅素成分的提取效果，均绿色高效。预计从两方面着手开展后续试验：一是放大验证不同提取方法的提取效果，为工业化提取二氢杨梅素提供数据支撑;二是分析二氢杨梅素的抗氧化功效，并将其应用于食品生产。

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