一测多评法测定槐花中3种黄酮类成分的含量

黄和军，崔小兵，杨军辉

中药槐花为豆科植物槐Sophora japonica L.的花蕾及干燥花，花蕾称为“槐米”，干燥花称为“槐花”。槐花主要功效为凉血止血，清肝泻火［1］，属于药食两用的中药［2-3］。槐花含有黄酮、皂苷、多糖等化学成分，另外还含有少量鞣质，其中黄酮类化合物占比较大［4］。芦丁是其主要黄酮类活性成分，其在酶或酸的作用下会水解成槲皮素［5］。现代药理研究表明槐花具有降血糖［6-8］、抗菌［9］、抗氧化［10］、止血［11-12］、增强免疫力［13-14］、清热凉血［15］、保护肠胃［16］等多种作用。

2015版药典中仅有槐花中芦丁的高效液相含量测定，并未见同时对槐花中多个成分含量测定的研究报道。本课题组前期已对槐花提取物发表过相关文章［17］，本研究以芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素为指标成分对槐花进行质量评价。但多指标评价常导致对照品消耗量大，因此引入一测多评法（QAMS）的质量评价模式。基于以上，本研究于2008年10月至2015年12月以芦丁作为内标物，分别计算芦丁与槲皮素和山柰酚-3-O-芸香糖苷的相对校正因子，并采用QAMS和外标法测定40批槐花药材中芦丁，山柰酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素的含量，比较两种测定方法之间的差异，旨在为槐花药材的质量控制提供新方法。

1 仪器与试剂

1.1仪器Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Shimadzu 10A高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；AY220 1/万电子分析天平；TGL 16G离心机（上海安亭科学仪器厂）；MUL-9000 Series超纯水系统（美国Millipore公司）；FW100型万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；HH-S恒温水浴锅（江苏国胜实验仪器厂）。

1.2试剂芦丁对照品（批号F20060526，国药集团化学试剂有限公司）、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品（批号WJ0322KA13，上海源叶生物科技有限公司）、槲皮素对照品（批号YA0806YB13，上海源叶生物科技有限公司）。40批生槐花批号依次为江苏131121，河北3050501，安徽140510，安徽20140601，江 苏 111018，河 北 140726，山 东 140323，安 徽140601，河南140401，河北140726，安徽140406，安徽 140504，山西 140409，国槐河北 140426，山东140402，山东140402，山东140625，湖北140524，河北304221，山东140512，安徽131203，安徽140602，安徽140408，江苏141015，江苏 141028江苏，141030，河北304308，河北304310，河北304314，安徽 20140518，安徽 20140601，山东 140412，山东140625，山东140408，山东140629，安徽131210，安徽140608，安徽140413，湖北140526，湖北140528，河南140403，河南140411。甲酸（色谱纯，批号607-001-00-0；德国Merck公司），甲醇（色谱纯，批号2014051033，山东禹王实业有限公司化工分公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品粉末：18.03 mg；槲皮素对照品粉末：2.13 mg；山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液：2.5 mL（0.21 mg/mL），用70%甲醇定容于5 mL的容量瓶，作为混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备取槐花药材粉末0.5 g；精密称定，置于50 mL容量瓶，采用70%甲醇超声提取30 min，离心10 min（14 000 r/min）取上清液，作为供试品溶液。

2.3色谱条件仪器：Waters 2695液相色谱系统；色谱柱：Inertsil® ODS-SP（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40℃；流速：1.0 mL/min；流动相：0.5%甲酸（B）∶甲醇（A）＝60∶40；进样量：10 μL；检测波长：254 nm。混合对照品、样品高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱法测定3种黄酮类成分的色谱图：A为混合对照品，B为样品

2.4方法学考察

2.4.1 线性关系考察 移取“2.1”项下的混合对照品溶液1 mL，依次稀释2倍，记作混标2、混标3、混标4、混标5，按“2.3”项下色谱条件分别进样10 μL，以峰面积为Y轴，浓度为X轴，绘制标准曲线，结果见表1。

2.4.2 精密度考察 精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液10 μL，按“2.3”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，分别计算3种成分峰面积的相对标准偏差（RSD）。结果3种成分峰面积RSD分别为0.91%，1.31%，0.97%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性考察 取同一批槐花药材（安徽131203）0.5 g，精密称定6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，计算得到芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素含量及RSD，结果见表2。

表2 高效液相色谱法测定槐花3种黄酮类成分的重复性考察/（mg/g）

结果表明：芦丁、山柰酚-3-O芸香糖苷、槲皮素的RSD分别为1.83%、1.84%、1.69%，表明该方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性考察 称取槐花（安徽131203）0.5 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件，分别于0，2，4，6，8，10，12 h进样，计算芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素含量及RSD，结果见表3。

表3 高效液相色谱法测定槐花3种黄酮类成分的稳定性考察/（mg/g）

结果表明：芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素含量的RSD分别为0.68%、0.76%、0.70%，表明槐花药材12 h的稳定性良好。

2.4.5 加样回收率考察 称取6份已知含量的槐花药材（安徽131203，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素含量分别为87.31 mg/g、2.29 mg/g、9.31 mg/g）0.25 g，分别按照含量的80%，100%，120%加入对照品溶液（芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素含量分别为2.18 mg/mL、0.055 mg/mL、0.24 mg/mL）8 mL、10 mL、12 mL，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表4。

其中芦丁回收率的范围为100.66%～104.77%、山柰酚-3-O-芸香糖苷回收率的范围为95.57%～104.47%、槲皮素回收率的范围为95.28%～104.66%，RSD小于3.00%。

2.5 相对校正因子的建立以芦丁作为内标物，取芦丁对照品进样得到相应的峰面积记作AS；对照品的浓度记作CS；校正因子f＝A/AS×CS/C，C＝f×A×CS/AS（其中A为被测物质的峰面积，C为被测物质浓度）。

2.5.1 相对校正因子的重现性考察 取槐花药材（安徽131203）按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定。同时采用芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素的对照品进行进样比较。其中对照品的含量分别为芦丁0.936 mg/mL；山柰酚-3-O-芸香糖苷0.055 mg/mL；槲皮素0.140 mg/mL。考察不同柱子、不同柱温、不同流速、不同流动相比例、不同仪器对相对校正因子的影响。结果见表5。试验结果表明，不同柱子、不同柱温、不同流速、不同流动相比例、不同仪器对山柰酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素的相对校正因子影响不大，RSD＜5%。

表5 不同柱子、柱温、流速、流动相比例、不同仪器下的校正因子及相对标准偏差（RSD）

表1 高效液相色谱法测定3种黄酮类样品的线性关系

表4 高效液相色谱法测定槐花3种黄酮类成分的加样回收率及相对标准偏差（RSD）/%

2.5.2 待测成分色谱峰定位以芦丁作为内标物，利用相对保留时间和化合物的紫外吸收特征峰定位色谱峰，考察不同柱子、不同柱温、不同流速、不同流动相比、不同仪器对相对保留时间的影响。结果见表6，试验结果表明，不同柱子、不同柱温、不同流速、不同流动相比例、不同仪器对相对保留时间影响较小，RSD＜5%。

表6 不同柱子、柱温、流速、流动相比、不同仪器校下的相对保留时间及相对标准偏差（RSD）

测定结果：校正因子f＝A/AS×CS/C，样品含量＝f×A×CS/AS。山柰酚-3-O-芸香糖苷相对保留时间在1.5左右，相对校正因子f槲皮素/芦丁＝0.513 4；槲皮素相对保留时间在2.6左右，相对校正因子f山柰酚-3-0-芸香糖苷/芦丁＝0.829 2，以此相对校正因子计算含量。

2.6 外标法与QAMS测定的比较取40批槐花药材按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定。分别采用QAMS与外标法计算40批槐花样品中芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素含量，结果表明40批槐花样品中3种黄酮用外标法测得的总量为（10.08±1.38）%，其中最低为7.14%，最高为13.97%；用QAMS相对校正因子测得的总量为（9.98±1.39）%，其中最低为7.01%，最高为13.88%，结果见表7。采用SPSS 16.0软件，对外标法和QAMS所测的槐花中芦丁、槲皮素和山柰酚-3-O-芸香糖苷含量进行独立样本t检验，统计结果见表8，两种方法测定结果差异无统计学意义（t＝0.324，P＝0.747）。

表7 40批槐花药材外标法与一测多评法（QAMS）测定结果/%

3 讨论

（1）本试验前期分别以30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇4种溶剂进行超声、回流、同时考察不同的提取时间、提取溶剂的体积，发现0.5 g槐花样品加入70%甲醇50 mL超声提取30 min，可获得比较好的效果；用甲醇-甲酸水溶液作为流动相体系，考察不同的流动相比例，以及不同甲酸浓度对分离效果的影响。经综合考察基线噪声、拖尾、分离度等因素的影响，最终采用流动相比为40∶60；甲酸浓度为0.5%作为槐花含量测定的色谱条件。

（2）本研究分别考察了不同色谱柱、不同仪器下3种黄酮类成分色谱峰的相对保留时间，结果显示各成分与芦丁内参物的相对保留时间变化较小。因此采用相对保留时间法进行槐花药材中各待测组分色谱峰的定位较为可靠。

（3）本试验以全国主产地40批槐花药材为研究样本，通过方法学验证、方法的耐用性试验、系统适用性等考察，对QAMS的适用性和实际应用可行性进行了比较研究。再采用SPSS 16.0软件，对外标法和QAMS所测的槐花中芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷和槲皮素含量进行独立样本t检验，结果P＝0.747，大于0.05，表明采用QAMS计算出的含量和外标法所测得的含量差异无统计学意义，提示本研究建立的校正因子可靠，能够实现在槲皮素和山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品缺乏的情况下，通过芦丁与槲皮素和山柰酚-3-O-芸香糖苷之间相对保留时间进行色谱峰定性，利用芦丁和校正因子计算槲皮素和山柰酚-3-O-芸香糖苷的含量。由于《中华人民共和国药典》2015年版一部“槐花”药材含量测定项下只测定芦丁的含量，本次试验所用槐花药材样本来源较广，可以认为此次采集的样本基本上可以反映全国主产地槐花药材的原始质量状态。因此本试验研究建立的QAMS含量测定方法可以作为槐花药材国家标准修订的重要参考依据。