毛蕊异黄酮抑制氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞凋亡研究

张彐宁,靳晓飞,周晓红,张 颖,高维娟

(河北中医学院河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北 石家庄 050091)

缺血性中风，又称脑梗塞，是指因缺血缺氧导致脑血流不足以维持正常功能，而导致脑血管梗塞或脑组织坏死的一类疾病[1]。缺血性中风往往造成患者失语、偏瘫、痴呆等后遗症，给患者家庭和社会带来巨大的经济负担和心理压力。目前，血流的早期恢复是治疗缺血性中风的最佳方法，但恢复血流有时可加剧脑组织损伤和神经功能障碍，并引起严重的病理反应——脑缺血/再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)损伤[2]。CIR引发神经元死亡的发生机制较为复杂，细胞凋亡(apoptosis)被认为是引起CIR神经元死亡的重要原因之一，通过抑制细胞凋亡减轻CIR损伤，对增加缺血性中风的治疗机会具有重要意义[3]。中药黄芪具有补气活血之功效，被历代医家用来治疗缺血性中风，并取得良好效果。毛蕊异黄酮是黄芪的主要活性成分之一，是黄芪黄酮类的单体成分，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、延缓衰老等生物作用[4]。本课题组前期观察了不同剂量的毛蕊异黄酮对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞的影响，结果发现不同剂量毛蕊异黄酮均可改善PC12细胞生长状态，提高细胞存活率，但其具体作用机制尚不明确。本实验应用氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞模型，模拟体外CIR损伤环境，探讨毛蕊异黄酮拮抗氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞损伤的凋亡作用机制。

1 材料

1.1 细胞PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系，经NGF诱导后，高分化具有交感神经元特性，批号：CX0247)购于BOSTER公司。

1.2 主要试剂毛蕊异黄酮(上海士峰生物制品有限公司，20mg /瓶，纯度≥98% ，批号：18060411)；CCK-8试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司，批号：70A11D)；尼莫地平(批号：DN0045)、Bax(批号：GB11007)和Bcl-2(批号：GB12008)一抗、Alexa Fluor488(批号：GB25301)和Cy3荧光(批号：174835)二抗均购自武汉赛维尔生物公司；caspase-3抗体(Gene Tex公司，批号：GTX110543)；AnnexinV FITC/PI双染色流式细胞术试剂盒(BD公司，批号：556547)；TUNEL染色试剂盒(Roche公司，批号：30967400)；二甲基亚砜(DMSO)(东京化成工业株式会社，批号：8KZ4ATP)；Triton X-100(批号：1109F0512)、青链霉素混合液(批号：20180706)、多聚赖氨酸(批号：P2100)均购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：20171115)；Earle’s平衡盐溶液(安徽雷根生物技术有限公司，批号：1019A18)；DMEM高糖培养基(批号：8118192)、1×PBS缓冲液(批号：8117042)均购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司。

1.3 主要仪器SW-CJ-ID型超净工作台购自苏州净化公司；DPX-9052B-1型电热恒温培养箱购自上海福玛实验设备有限公司；3111型二氧化碳(CO2)培养箱、Multiskan FC型酶标仪、3131型三气培养箱均购自美国Thermo公司；Axio Observer 7型倒置荧光显微镜购自德国Carl Zeiss公司；多功能成像系统购自Vilber公司；流式细胞仪FC 500 MCL型购于Beckman公司。

2 方法

2.1 细胞培养PC12细胞用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清和1%青链霉素)置于5%CO2、湿度适宜、37℃的CO2培养箱内进行培养，当细胞密度生长至80%时进行传代。

2.2 实验分组、模型建立和给药实验分为4组：正常对照组(Control)、氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)组(Model)、毛蕊异黄酮组(Calycosin，0.07 μmol·L-1)、尼莫地平组(Nimodipine，5.00 μmol·L-1)。除Control组外，其它各组均氧糖剥夺2 h后复氧复糖24h，建立 OGD/R细胞模型：弃去正常细胞培养液，用PBS清洗细胞2遍，换为无糖Earle’s细胞培养液，模拟细胞缺血状态，随后立即将细胞放入三气培养箱(37℃，94%N2+1%O2+5%CO2，湿度适宜)，氧糖剥夺2 h处理，然后更换回正常细胞培养液，放入CO2培养箱中继续培养24 h。Control组正常培养，不做其他任何处理；Calycosin组和Nimodipine组在复氧复糖的同时分别给予含有毛蕊异黄酮(作用浓度为0.07 μmol·L-1)、尼莫地平(作用浓度为5.00 μmol·L-1)的含药培养基处理，直至细胞培养结束。

2.3 CCK-8检测各组细胞存活率将上述PC12细胞以1×105个·mL-1单层接种于96孔板，每组设置6个复孔，除Control组外，其余各组细胞进行造模处理，造模给药处理后各组细胞每孔加入10μL CCK-8试剂，于细胞培养箱内孵育50min，取出各组细胞，酶标仪检测各孔450 nm波长下的吸光(OD)值。细胞存活率/%=(实验组OD值-空白组OD值)/(正常组OD值-空白组OD值)×100%。

2.4 流式细胞术检测各组细胞凋亡率取上述相同处理方式的细胞单层接种于6孔板中，造模、给药处理后，取出各组细胞，分别收集各组细胞上清液，用胰蛋白酶消化细胞，1500 r·min-1离心5 min，用提前预冷的PBS清洗细胞2遍，100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，每组细胞加入FITC和PI各5μL，室温避光反应15min，加入400 μL 1×Binding Buffer，上机检测各组细胞凋亡率。

2.5 TUNEL染色检测各组细胞凋亡指数将上述PC12细胞以1×105个·mL-1单层接种于6孔板中，造模完成后，将各组细胞爬片取出，用多聚甲醛溶液固定25min，洗去固定液，加入50～100μL含0.2%Triton X-100溶液于每个爬片上，室温透膜20 min，H2O2室温处理细胞5 min，加入TUNEL反应混合液50 μL(TdT ∶dUTP=1 ∶9)，Control组只加入50 μL dUTP液，避光37℃孵育60 min，滴加50 μL converter-POD于细胞爬片，避光37℃孵育30min，随后滴加100 μL DAB，避光室温孵育10min，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，阳性细胞(即凋亡细胞)细胞核被染为棕黄色，显微镜下每组细胞随机选取6个视野，观察各组细胞凋亡情况。凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数。

2.6 免疫荧光染色检测各组细胞Bax/Bcl-2比值各组细胞爬片、固定、破膜同上，细胞破膜后，加入4%BSA室温封闭30min，甩掉封闭液后，滴加配好的Bax多克隆抗体(1 ∶100)和Bcl-2单克隆抗体(1 ∶100)50～100 μL于爬片上，湿盒内4℃过夜，洗去一抗，滴加山羊抗小鼠IgG(1 ∶300)和驴抗兔IgG(1 ∶200)二抗，室温避光孵育60 min，洗去二抗，滴加DAPI染液室温避光10 min，封片，荧光显微镜下随机选取6个视野，观察各组细胞的荧光表达。Bax为红色荧光，Bcl-2为绿色荧光，采用Image-Pro Plus 6.0软件分析Bax与Bcl-2的荧光强度值，并计算Bax/Bcl-2比值。

2.7 Western blot检测各组细胞caspase-3蛋白表达造模给药处理后，分别收集各组PC12细胞，用预冷PBS 洗涤2遍，加入RIPA 细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液，震荡混匀，高温变性10 min，SDS-PAGE 电泳分离，湿转1.5 h，室温奶粉封闭2 h，滴加caspase-3一抗(1 ∶1000)，4℃过夜，TBST洗去一抗，滴加二抗(1 ∶2500)室温孵育1 h，TBST洗去二抗，配制ECL发光液，置于多功能成像系统中扫描成像，采用Image J软件对Western blot条带进行分析，分析目的条带/对应内参的相对表达量。

3 结果

3.1 CCK-8检测各组细胞存活率的结果如Fig 1所示，与Control组相比，给予氧糖剥夺/复氧复糖处理后，Model组细胞存活率明显降低(P<0.05)，提示氧糖剥夺/复氧复糖引起PC12细胞损伤；与Model组相比，Calycosin组和Nimodipine组细胞存活率均明显升高(P<0.05)，差异有统计学意义。

Fig 1 Viability of cells in each group

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

3.2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率的结果如Fig 2所示，与Control组相比，给予氧糖剥夺/复氧复糖处理后，Model组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与Model组相比，Calycosin 组和Nimodipine组细胞凋亡率均明显降低(P<0.05)，差异有统计学意义。

3.3 TUNEL染色检测各组细胞凋亡指数的结果如Fig 3所示，与Control组相比，给予氧糖剥夺/复氧复糖处理后，Model组出现细胞核被棕染的阳性凋亡细胞，细胞凋亡指数明显升高(P<0.05)；与Model组相比，Calycosin 组和Nimodipine组细胞凋亡指数均明显降低(P<0.05)，差异有统计学意义。

3.4 免疫荧光染色检测各组细胞Bax/Bcl-2比值的结果如Fig 4所示，与Control组相比，给予氧糖剥夺/复氧复糖处理后，Model组Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，Bax/Bcl-2比值明显升高(P<0.05)；与Model组相比，Calycosin 组和Nimodipine组Bax/Bcl-2比值均明显降低(P<0.05)，细胞凋亡程度明显减轻，差异有统计学意义。

3.5 Western blot检测各组细胞caspase-3蛋白表达的结果如Fig 5所示，与Control组相比，给予氧糖剥夺/复氧复糖处理后，Model组caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05)；与Model组相比，Calycosin组和Nimodipine组caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05)，细胞凋亡程度明显减轻，差异有统计学意义。

Fig 2 Apoptotic rate of each group detected by flow cytometry n=6)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

4 讨论

关于缺血性中风的治疗，临床上多采用溶栓疗法和外科手术来恢复缺血区的血流供应，但恢复血流的同时产生的CIR损伤也逐渐成为临床上的难题[2]。CIR损伤的发生机制十分复杂，主要涉及细胞凋亡、自噬、氧化应激、炎性反应等因素的影响，各因素之间相互作用，最终导致神经细胞死亡[5]。细胞凋亡是指在体内外多种因素的诱导下，由严格和复杂的信号网络调控而发生的自主性细胞有序死亡过程[6]。细胞凋亡是CIR损伤病理进程中的重要环节，再灌注引起的神经细胞死亡以细胞凋亡为主，其主要在缺血病灶的周围半暗带区域发生，神经功能障碍的严重程度、脑梗死体积的大小均与其密切相关[7,8]。因此，有效抑制细胞凋亡的发生对于减轻CIR损伤具有重要意义。

脑缺血/再灌注后，各种内外因素的刺激，使位于线粒体内、外膜的通透转换孔PTP开放，CytC、AIF等促凋亡物质由线粒体膜间隙释放入胞质，与胞质中的凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1结合，同时与Procaspase-9形成凋亡酶体复合物，即凋亡小体，进而激活caspase-3，引起caspase连锁反应，使细胞走向凋亡[9]。在此过程中，Bcl-2蛋白家族发挥了重要作用，其中Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族里面重要的凋亡调控蛋白，而caspase-3在凋亡发生的执行过程中发挥了关键作用。当细胞受到缺血等刺激时，位于胞质中的Bax向线粒体膜聚集，促使线粒体膜通透性改变，进而释放CytC，导致caspase-3活化，最终诱导细胞凋亡；而Bcl-2作为一种与线粒体相关的膜稳定蛋白，能够维持和保护膜的稳定性，与Bax形成异源二聚体，抑制caspase-3活化，阻止细胞凋亡的发生[10]。由此可见，Bax、Bcl-2、caspase-3在细胞凋亡的发生发展过程中发挥着关键作用，其三者常作为检测细胞凋亡的重要参考指标。

Fig 3 Apoptotic index of each group detected by TUNEL staining n=6) (scale bar=20μm)

Arrow indication: Positive cell. Damaged cells after OGD/R, the nucleus was stained brown.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

Fluorescent images : green, Bcl-2; red, Bax; blue, DAPI.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

Fig 5 Protein expression of caspase-3 of each group detected by Western blot n=6)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

黄芪始载于《神农本草经》，被誉为补气圣药，具有补气活血、行滞通痹之功效，被历代医家用治气虚血滞，半身不遂，痹痛麻木等症[11]，并取得良好效果。黄芪治疗中风的历史较为悠久，清代医家王清任更是重用黄芪，以黄芪为君药首创治疗缺血性中风的名方——补阳怀五汤，收到了良好的临床效果，并且一直被临床上沿用至今。现代药理学研究发现，黄芪的主要成分有：黄酮类、皂苷类、多糖类三种，研究已证实，黄芪三大成分在调控自噬、抗炎、抗氧化、调节血压、促进干细胞增值、改善认知功能障碍等方面发挥着重要作用[12]。毛蕊异黄酮为黄芪黄酮类的单体成分，近年来开始受到更多的关注，研究发现毛蕊异黄酮具有调控自噬、调节钙稳态、抗氧化、延缓衰老、促进细胞增殖、抗炎等生物作用[13,14]。Liu等[15]探讨了毛蕊异黄酮对氧化应激诱导的缺血性心脏病心肌细胞凋亡的影响，结果证实毛蕊异黄酮以剂量依赖性方式降低H2O2的表达，增强心肌细胞中Akt磷酸化而表现出抗细胞凋亡作用。那么，毛蕊异黄酮在脑缺血再灌注损伤中是否同样具有抑制细胞凋亡、拮抗脑损伤的作用？尚缺乏研究。

本课题组前期研究发现，不同剂量的毛蕊异黄酮均可明显改善氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞的生长状态，提高细胞存活率，明显减轻细胞损伤，发挥保护作用。本实验在前期研究的基础上，选取毛蕊异黄酮最佳作用剂量，通过建立氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞模型，在细胞水平，观察毛蕊异黄酮对氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响，探讨毛蕊异黄酮拮抗脑缺血再灌注损伤的凋亡作用机制。实验结果发现，PC12细胞给予氧糖剥夺/复氧复糖处理后，细胞存活率明显降低，细胞凋亡率和凋亡指数均明显升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax表达升高，Bax/Bcl-2比值升高，凋亡蛋白caspase-3表达明显升高；而当分别给予毛蕊异黄酮和尼莫地平处理后，PC12细胞存活率明显升高，细胞凋亡率和凋亡指数均降低，Bax/Bcl-2比值和凋亡蛋白caspase-3表达均明显降低，表明毛蕊异黄酮可提高氧糖剥夺/复氧复糖PC12细胞存活率，抑制细胞凋亡，发挥保护作用，其分子机制与毛蕊异黄酮调控凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表达密切相关。