沉默Fis1基因对METH诱导体外培养SH-SY5Y细胞增殖能力、线粒体膜电位和超微结构的影响

黄仕美，牟登峰，王 琪，郑 丹，齐晓岚，官志忠，于燕妮，楼迪栋

(1. 贵州医科大学法医学院法医病理学教研室， 贵州 贵阳 550004； 2. 贵阳妇幼保健院围产期保健科，贵州 贵阳 550004；3. 贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室，贵州省医学分子生物重点实验室，贵州 贵阳 5500044. 贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳 550004)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)因毒性较低、起效较快、作用持久，并趋向低龄化，已严重危害到公共卫生安全和社会安全。探索METH致神经细胞的神经毒性机制，获取治疗和预防METH神经毒性的方法已迫在眉睫。研究认为，线粒体病理过程与METH致细胞损伤密切相关，包括线粒体氧化还原平衡[1]、线粒体自噬[2]、线粒体钙管理[3]、线粒体能量合成[4]和线粒体促凋亡因子释放[5]。线粒体过度分裂产生新的线粒体，新生线粒体膜电位较低、线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)含量低[1,6]，这些受损的线粒体不能产生足够的ATP来促进细胞新陈代谢，而且释放出促凋亡因子进入细胞质/细胞核，以启动线粒体凋亡途径[7-8]。例如，在内皮氧化损伤中，线粒体分裂损害线粒体DNA转录和复制，并因此抑制线粒体呼吸复合物的表达[6]，导致ATP消耗。我们前期研究发现，METH可诱导体外培养人神经母细胞瘤细胞(human neuroblastoma cells，SH-SY5Y cells)增殖能力减弱，线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)水平下降，线粒体超微结构改变，线粒体趋向分裂，启动线粒体自噬，并发现线粒体融合蛋白1(mitofusin 1，Mfn1)和线粒体分裂蛋白1(fisson 1，Fis1)蛋白表达异常，这些线粒体形态与功能改变可能与Mfn1和Fis1调节的线粒体动力学有关。为进一步探索METH诱导SH-SY5Y细胞毒性损伤与Fis1之间的相互关系，本研究拟通过沉默Fis1基因，下调Fis1蛋白表达后，检测和观察METH诱导SH-SY5Y细胞增殖能力、MMP水平和线粒体超微结构，探讨Fis1在METH诱导体外培养SH-SY5Y细胞增殖能力、线粒体膜电位和超微结构变化中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞SH-SY5Y细胞，购于Sigma公司。

1.2 试剂与仪器METH(美国Cerilliant公司，标准品编号：M-009，纯度：99.9%)；siRNA(上海吉玛制药技术有限公司)；脂质体LipofectamineTM3000(美国Invitrogen公司)；JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清(美国BI公司)；兔抗人Fis1单克隆抗体(美国Abmart公司)；兔抗人β-actin抗体(美国Gene Tex公司)。恒温细胞培养箱、ND2000型超微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)；ELX800UV酶标仪、化学发光成像系统(美国Bio-Rad公司)；DMi8型倒置显微镜(德国Leica公司)；H-7650型透射电镜(日本Hitachi公司)；AllegraX-30R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)。

1.3 细胞培养、转染及METH处理将体外培养SH-SY5Y细胞冻存管迅速放入37 ℃恒温水浴箱中，轻轻摇动融化后移入培养瓶中，并加入4 mL的完全培养基(90%高糖DMEM培养基+10%灭活胎牛血清+1%双抗)，轻柔匀速吹打细胞制成单细胞悬液，放入37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。次日更换培养基，继续放入恒温箱中培养。待培养瓶中细胞贴壁长至80%～90%时，将细胞按1×106·mL-1的密度接种于6孔培养板。待细胞贴壁生长至70%～80%进行转染，转染实验按照说明书严格操作。分组：未沉默组(0 mmol·L-1METH、1.0 mmol·L-1METH、2.0 mmol·L-1METH)；沉默阴性组(0 mmol·L-1METH+siRNA-NC、1.0 mmol·L-1METH+siRNA-NC、2.0 mmol·L-1METH+siRNA-NC)，siRNA-NC非特异性序列：5′-UUCUCCGA ACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGUGACACGUUCGGAGA ATT-3′；沉默组(0 mmol·L-1METH+siRNA-Fis1、1.0 mmol·L-1METH+siRNA-Fis1、2.0 mmol·L-1METH+siRNA-Fis1)，siRNA-Fis1特异性序列：5′- GCUGUGUCCAAGUCCAAAUTT-3′，5′-AUU UG GACUUGGACACAGC TT- 3′。METH诱导未沉默组、沉默阴性组和沉默组24 h，浓度和时间选择参照文献[9]和细胞增殖-毒性检测实验(CCK-8)结果。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖将siRNA-Fis1和siRNA-NC分别转染后的细胞消化、吹打成单细胞悬液，按1×104个/孔接种于96孔培养板中，放入37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。待细胞贴壁长至60%～70%时，换含有METH(0、1.0、2.0 mmol·L-1)的培养液培养，未沉默组、沉默阴性组和沉默组的每个浓度做6个复孔，METH诱导24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，将96孔板放入37 ℃、5% CO2恒温培养箱中孵育3 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(OD)值，并计算细胞存活率。细胞存活率/%=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.5 Western blot法检测Fis1蛋白表达水平使用RIPA裂解细胞提取总蛋白，超微量紫外分光光度计检测各样本蛋白浓度。经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白(浓缩胶电泳80 V，分离胶电泳120 V)、转膜(100 V，45 min。)、室温封闭2 h后，一抗Fis1(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶5 000)4 ℃孵育过夜，二抗(1 ∶10 000)室温孵育1 h。将PVDF膜与超敏发光液(ECL)试剂反应1 min后，使用化学发光成像系统扫描PVDF膜，ImageJ软件分析Fis1蛋白条带，使用β-actin蛋白条带校正。

1.6 MMP检测采用JC-1法，按照试剂盒说明书操作。使用倒置荧光显微镜观察METH诱导SH-SY5Y细胞24 h后的各组细胞的红、绿荧光，计算机采集荧光图像，使用ImageJ软件重叠红绿荧光，将合成荧光的光密度比值作为膜电位表达水平值。

1.7 透射电镜观察体外培养SH-SY5Y细胞线粒体超微结构收集细胞；将细胞固定于2.5% 戊二醛溶液中4 h(4 ℃)，0.1 mol·L-1PBS漂洗；1%锇酸溶液后固定2 h(4 ℃)，0.1 mol·L-1PBS漂洗；丙酮脱水；Epon812树脂包埋；切片；醋酸铀、硝酸铅染色；在H-7650型透射电镜下，根据观察内容不一选择不同的放大倍数进行超微结构观察和拍照；每个样本随机拍片9张，同时避免同一细胞重复拍照。将类圆形(短轴/长轴≥0.7)线粒体定义为小球状线粒体，短轴/长轴<0.7的线粒体定义为棒状线粒体，并排除因为图片质量模糊等原因不能明确定义形态的线粒体。计数每组样本中棒状线粒体数和小球状线粒体数，小球状线粒体数与棒状线粒体数比值代表线粒体分裂水平。

2 结果

2.1 CCK-8法检测结果如Fig 1所示，使用METH(0、1.0、2.0 mmol·L-1)诱导体外培养SH-SY5Y细胞24 h后，SH-SY5Y细胞存活率随METH浓度的增加而减小(P<0.05)，METH抑制SH-SY5Y细胞增殖。且在2.0 mmol·L-1METH诱导下，沉默组细胞存活率明显高于未沉默组和沉默阴性组(P<0.05)。

2.2 沉默Fis1基因对Fis1蛋白表达的影响如Fig 2所示，未沉默组、沉默阴性组和沉默组中，各组组内与对照组(0 mmol·L-1METH)比较， 1.0和2.0 mmol·L-1METH诱导SH-SY5Y细胞，Fis1蛋白表达水平分别升高31%、47%，32%、45%，22%、51%(P<0.05)；与未沉默组相同浓度比较，沉默组Fis1蛋白表达水平分别降低27%、32.5%、25%(P<0.05)；与沉默阴性组相同浓度比较，沉默组Fis1蛋白表达水平分别降低31%、36%、28%(P<0.05)。

Fig 1 Effect of METH on survival rate of SH-SY5Y cells cultured in vitro

2.3 SH-SY5Y细胞MMP水平如Tab 1、Fig 3所示，未沉默组、沉默阴性组和沉默组中，各组组内与对照组(0 mmol·L-1METH)比较， 1.0和2.0 mmol·L-1METH诱导SH-SY5Y细胞，MMP水平降低(P<0.05)，荧光显微镜下，随METH浓度增加，SH-SY5Y细胞红色荧光减弱，绿色荧光增强；与未沉默组和沉默阴性组相同浓度比较，沉默组MMP水平升高(P<0.05)，红色荧光增强。

Tab 1 MMP red-green overlapping fluorescence ratio of SH-SY5Y cells cultured in vitro between control groups and METH treatment groups n=3)

*P<0.05vscontrol

2.4 METH对SH-SY5Y细胞线粒体超微结构的影响如Tab 2、Fig 4所示，与对照组(0 mmol·L-1METH)比较，未沉默组、沉默阴性组和沉默组在2.0 mmol·L-1METH诱导24h后，透射电镜观察见各组线粒体小球状结构增加，线粒体分裂水平明显增高(P<0.01)；与未沉默组和沉默阴性组比较，沉默组线粒体分裂水平差异无显著性(P>0.01)。未沉默组和沉默阴性组中部分线粒体呈现出空泡化，损伤严重，同时在沉默阴性组中发现自噬溶酶体，沉默组中个别棒状结构的线粒体内外膜完整，线粒体嵴清晰可见。

Tab 2 Comparison of ratio of small globular mitochondria to rod-like mitochondria in SH-SY5Y cells cultured in vitro for 24 h (n=9)

**P< 0.01vscontrol

3 讨论

METH俗称“冰毒”，具有极强的精神兴奋和致幻作用，METH长期滥用已严重危害社会安全，探明METH的神经毒性机制可为预防和治疗METH的神经毒性作用探寻高效、便捷的靶点。Parameyong等[9]研究认为，METH通过诱导线粒体分裂途径，引起SH-SY5Y细胞线粒体动力学紊乱，参与线粒体碎裂成小球状结构。此外，MMP的下降是线粒体膜损伤和细胞凋亡的早期指标，此过程与线粒体不断的分裂有关[10]。线粒体分裂过度或融合不足都会导致线粒体碎裂，降低呼吸作用和能量生产，增加神经元损伤和细胞凋亡的可能性[11]。Fis1的过度表达可以导致线粒体分裂，造成线粒体功能障碍，导致细胞凋亡，药物抑制分裂可以减轻细胞凋亡[12]。我们前期实验也发现[13]，METH可诱导体外培养SH-SY5Y细胞增殖能力减弱，MMP水平下降，线粒体超微结构改变，线粒体趋向分裂，启动线粒体自噬，并发现Mfn1和Fis1蛋白表达异常，这些线粒体形态与功能改变可能与Mfn1和Fis1调节的线粒体动力学有关。为了进一步研究Fis1在METH诱导SH-SY5Y细胞损伤中的重要作用，本实验通过基因干扰法，沉默Fis1基因，探讨Fis1在METH诱导SH-SY5Y细胞损伤中的作用。

Fig 2 Expression of Fis1 protein in SH-SY5Y cells n=3))*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs silent negative group

Fig 3 MMP in SH-SY5Y cells cultured in vitro detected by red-green overlapping fluorescence (×400) Green arrows indicate the normal MMP, while red arrows indicate the decreased MMP.

Fig 4 Observation of mitochondrial ultrastructure of SH-SY5Y cells by TEM (scale bar= 5 μm)

A: Control groups, mitochondria elliptical rod-like structure, normal and clear; B: Unsilent groups: mitochondrial globular structure increased significantly (arrow); C: Silent negative groups: mitochondrial globular structure increased significantly (arrow); D: Silent groups, mitochondrial globular structure decreased, rod structure increased (arrow). M: mitochondria; N: nuclei.

实验发现，CCK-8实验中，未沉默组、沉默阴性组和沉默组随着METH浓度增加，细胞存活率均减小(P<0.05)，表明METH对体外培养SH-SY5Y细胞具有毒性作用；且未沉默组和沉默阴性组细胞存活率减小趋势相近，表明沉默试剂对细胞无毒性作用或毒性作用微小，不足以降低细胞存活率，排除沉默试剂对细胞毒性的干扰；同时发现，2.0mmol·L-1METH诱导SH-SY5Y细胞24 h后，与未沉默组和沉默阴性组比较，沉默组对应细胞存活率明显提高(P<0.05)，表明沉默Fis1基因可以减轻细胞损伤，提高细胞增殖能力。进一步研究发现，体外培养SH-SY5Y细胞经METH诱导24h后，未沉默组、沉默阴性组和沉默组组内的MMP水平随METH的浓度增高呈现降低趋势(P<0.05)，但与未沉默组和沉默阴性组相同浓度相比，沉默组MMP水平呈现上升趋势(P<0.05)，MMP得以恢复或接近正常水平，表明沉默Fis1基因对稳定MMP水平起到重要作用。透射电镜下观察见对照组线粒体多呈现棒状结构，线粒体内外膜结构良好，线粒体嵴清晰、正常；未沉默组和沉默阴性组线粒体多为小球状结构，部分空泡化，并再次观察到自噬现象，和前期实验现象基本一致[13]；沉默组中个别棒状结构的线粒体内外膜保持良好，线粒体嵴清晰可见，虽然与未沉默组和沉默阴性组比较，统计球状小泡结构/棒状结构(A/B)无明显统计学意义，但A/B值下降仍很明显；这也部分表明沉默Fis1基因可以抑制Fis1蛋白表达，从而可能减弱线粒体过度分裂，线粒体损伤程度得以减轻。沉默Fis1基因，Fis1蛋白表达水平下调，透射电镜下观察线粒体超微结构部分改善，MMP水平上升，细胞增殖能力增强。我们推测，沉默Fis1基因抑制Fis1蛋白表达后，线粒体分裂功能下降，稳定线粒体膜结构，提高MMP水平，降低METH对体外培养SH-SY5Y细胞的神经毒性作用，可恢复细胞增殖功能。

综上所述，沉默Fis1基因，可下调Fis1蛋白表达，可降低线粒体分裂水平和线粒体膜损伤，部分恢复SH-SY5Y细胞增殖能力。线粒体功能紊乱可能是METH诱导体外培养SH-SY5Y细胞神经毒性的重要机制之一，Fis1可能在METH诱导体外培养SH-SY5Y细胞线粒体形态与功能紊乱中起关键作用。