Exendin-4对高脂饮食载脂蛋白E基因敲除小鼠脂代谢及炎症因子的影响

涂 强，吴瑞霞，杨 勇，谢 华， 谢华强，陈平英， 曹 政，2

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是严重危害国民健康的重大疾病。脂质代谢紊乱和炎症反应是动脉粥样硬化发生发展的重要因素，调脂和抗炎治疗是防治动脉粥样硬化的有效措施[1]。Exendin-4是胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受体激动剂，为首个在美国获准的肠促胰岛素拟似物。近年来研究发现，Exendin-4除调节血糖外，对保护血管内皮、调节脂质代谢等均有积极作用，表明其在动脉粥样硬化等心脑血管疾病的防治方面具有潜在价值[2]。因此，本研究观察Exendin-4对高脂饮食载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E gene knockout，ApoE-/-)小鼠脂代谢、白细胞介素-6(interlenkin-6，IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)及血管内皮细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1)表达的影响，初步探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 ApoE-/-小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK-京-2012-0001)；Exendin-4购自MedChem Express公司；普通饲料购自武汉万千佳兴生物科技有限公司，高脂饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司(H1014，含21%乳脂、0.15%胆固醇)。逆转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)试剂盒购自TIANGEN公司；IL-6抗体、MCP-1抗体和VCAM-1抗体及β-actin抗体均购自美国Santa Cruz公司；酶联免疫反应试剂盒购自上海联硕生物科技公司；其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 分组及给药 选用清洁级7～8周的雄性ApoE-/-小鼠40只，体重22～25 g，适应性饲养1周后，随机分为普通饮食组(10只)和高脂饮食组(30只)，喂养8周后再将高脂饮食组随机分为非药物干预组、Exendin-4低剂量组、Exendin-4高剂量组，每组10只。Exendin-4低剂量组、Exendin-4高剂量组ApoE-/-小鼠分别给予20 μg/(kg·d)、 100 μg/(kg·d)Exendin-4腹腔内注射；普通饮食组、非药物干预组ApoE-/-小鼠给予0.1 mL生理盐水腹腔内注射。小鼠定期测量体重，调整用药量。本实验经湖北医药学院动物管理委员会依据湖北医药学院动物实验室动物准则批准。

1.3 标本的采集及处理 实验动物连续喂养12周。取材前禁食12 h，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，摘除眼球采血，室温静置1 h，4 000 r/min常温离心10 min，收集上清并置于-80 ℃冰箱保存。取血完毕后，迅速开胸，取胸腹主动脉全长，用0.9%氯化钠冲洗干净，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 血液生化检测 采用全自动生化分析仪检测总胆固醇(cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。

1.5 RT-PCR分析小鼠主动脉IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA水平 取冻存于-80 ℃冰箱的小鼠主动脉组织，按试剂盒提取总RNA，利用260 nm及280 nm吸光度计算RNA的纯度及浓度，取总RNA逆转录为cDNA，按RT-PCR试剂盒进行PCR反应，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列为：β-actin 上游5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′；IL-6上游5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3，下游5′-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3′；MCP-1上游5′-TTCTTCGATTTGGGTCTCCTTG-3′，下游5-GTGCAGCTCTTGTCGGTGAA-3′；VCAM-1上游5′-AGTTGGGGATTCGGTTGTTCT-3′，下游5′-CCCCTCATTCCTTACCACCC-3′。反应条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行32个循环。反应结束后，取各组PCR产物8 μL，经1%琼脂糖凝胶电泳，120 V电压电泳20 min，凝胶成像仪摄像，计算目标条带灰度，并以β-actin的灰度作为标准对比。

1.6 Western Blot检测小鼠主动脉IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表达 取冻存于-80 ℃冰箱的小鼠主动脉置入含蛋白酶抑制剂及RIPA裂解液中匀浆，匀浆液于4 ℃ 14 000 r/min离心15 min，取上清收集蛋白并测定蛋白浓度，将上样总蛋白调至一致。蛋白经10% SDS-PAGE电泳，并转印IL-6、MCP-1及VCAM-1至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，用相应的特异性一抗4 ℃孵育过夜，再经洗膜，然后孵育相应二抗室温2 h后，采用碱性磷酸酶显色试剂盒显影，Image-Pro Plus 6.0软件分析目标条带的累积光密度值，并与内参β-actin比较。

1.7 小鼠血清IL-6、MCP-1及VCAM-1水平检测 采用双抗体夹心法ELISA试剂盒进行操作，显色终止后于450 nm及630 nm波长测量吸光度，通过建立标准曲线计算出样品浓度。

2 结 果

2.1 Exendin-4对小鼠血脂水平的影响 与普通饮食组比较，非药物干预组小鼠TC、LDL-C水平明显增高(P<0.01)，提示高脂饮食可明显加剧ApoE-/-小鼠脂质代谢紊乱。与非药物干预组相比，Exendin-4高剂量组小鼠TC及LDL-C水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。各组小鼠TG及HDL-C水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 Exendin-4对小鼠血清脂质水平的影响(±s) mmol/L

与普通饮食组比较，1)P<0.01；与非药物干预组比较，2)P<0.05，3)P<0.01；与Exendin-4低剂量组比较，4)P<0.05，5)P<0.01

2.2 Exendin-4对小鼠主动脉IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA表达的影响 以β-actin作为对照，与普通饮食组相比，非药物干预组IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA相对表达量均明显增高(P<0.01)，给予Exendin-4处理后，Exendin-4低剂量组、Exendin-4高剂量组IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA表达较非药物干预组明显降低(P<0.05或P<0.01)，且Exendin-4高剂量组IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA表达低于Exendin-4低剂量组(P<0.01)。详见图1、表2。

A为普通饮食组；B为非药物干预组；C为Exendin-4低剂量组；D为Exendin-4高剂量组

组别 只数 IL-6 mRNA MCP-1 mRNAVCAM-1 mRNA普通饮食组10 1.00±0.01 1.01±0.08 1.00±0.02 非药物干预组 10 1.99±0.121) 2.08±0.211) 1.68±0.291)Exendin-4低剂量组 10 1.69±0.072) 1.91±0.682) 1.51±0.412)Exendin-4高剂量组 10 1.39±0.053)4) 1.23±0.843)4) 1.29±0.673)4)

与普通饮食组比较，1)P<0.01；与非药物干预组比较，2)P<0.05，3)P<0.01；与Exendin-4低剂量组比较，4)P<0.01

2.3 Exendi-4对小鼠主动脉IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表达的影响 与普通饮食组相比，非药物干预组IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白的表达量明显增加(P<0.01)。Exendin-4低剂量组、Exendin-4高剂量组IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表达较非药物干预组明显降低(P<0.05或P<0.01)，且Exendin-4高剂量组IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表达低于Exendin-4低剂量组(P<0.05或P<0.01)。详见图2、表3。

A为普通饮食组；B为非药物干预组；C为Exendin-4低剂量组；D为Exendin-4高剂量组

表3 各组小鼠主动脉IL-6、MCP-1及VCAM-1 蛋白表达情况(±s)

与普通饮食组比较，1)P<0.01；与非药物干预组比较，2)P<0.05，3)P<0.01；与Exendin-4低剂量组比较，4)P<0.05，5)P<0.01

2.4 Exendi-4对小鼠血清IL-6、MCP-1和VCAM-1水平的影响 普通饮食组小鼠血清中IL-6、MCP-1和VCAM-1水平均较低，非药物干预组小鼠血清中IL-6、MCP-1和VCAM-1水平较普通饮食组明显升高(P<0.01)，提示高脂饮食可明显加剧ApoE-/-小鼠炎症反应。给予Exendin-4处理后，Exendin-4低剂量组、Exendin-4高剂量组血清中IL-6、MCP-1和VCAM-1水平较非药物干预组明显降低(P<0.05或P<0.01)，且Exendin-4高剂量组血清中VCAM-1水平低于Exendin-4低剂量组(P<0.01)。详见表4。

表4 Exendin-4对小鼠血浆IL-6、MCP-1和VCAM-1含量的影响(±s)

与普通饮食组比较，1)P<0.01；与非药物干预组比较，2)P<0.05，3)P<0.01；与Exendin-4低剂量组比较，4)P<0.01

3 讨 论

既往研究表明，在动脉粥样硬化发生发展过程中，脂质代谢紊乱和炎症反应是相伴而生的，炎症可导致脂质代谢紊乱，脂质代谢紊乱又可加重炎症反应[3]。因此，对动脉粥样硬化的有效防治，需要对脂质代谢进行调节，同时抑制促炎因子的表达或促进抗炎因子的表达。

载脂蛋白是血浆脂蛋白的重要组成部分，在机体脂质尤其是总胆固醇的代谢中发挥着极其重要的作用[4]。ApoE-/-小鼠能自发形成与人类相似病理特征的动脉粥样硬化斑块，是研究动脉粥样硬化病理过程的良好动物模型，高脂饮食可以明显促进动脉粥样硬化的进程[5]。

本研究选择IL-6、MCP-1和VCAM-1作为动脉粥样硬化炎症反应的指标。IL-6是一种多功能炎症细胞因子，具有广泛生物学特性。当血管内皮功能受损时，IL-6可不同程度升高，并通过刺激巨噬细胞分泌MCP-1，从而上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)表达，加重血管壁炎症反应[6]。同时，IL-6可以诱导血小板源性生长因子的生成从而促进平滑肌细胞增殖，进而促进动脉粥样硬化的进展[7]。MCP-1作为趋化性细胞因子超家族CC亚家族中的一员，是炎症反应发生的主要趋化因子之一，在炎症反应发生时，促进单核细胞穿过内皮，进入内皮下，逐步分化成为巨噬细胞进而演变成为泡沫细胞，形成动脉粥样硬化早期脂肪条纹病变[8]。VCAM-1又名CD106，属于免疫球蛋白超家族，主要表达于血管内皮细胞、巨噬细胞及平滑肌细胞表面[9]。在病理因素刺激下，内皮细胞高表达VCAM-1，VCAM-1不仅促使白细胞向炎症部位募集，同时又可以被白细胞介素-1(interlenkin-1，IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎症因子激活，形成级联反应，因此VCAM-1被认为是炎症反应的早期事件，同时是动脉粥样硬化的病理基础[10]。Exendin-4是GLP-1受体激动剂，最初从美国毒蜥唾液中分离得到的含有39个氨基酸的多肽，与哺乳动物GLP-1有53%同源性，和胰高血糖素样肽受体1(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)结合产生相应的生物学效应[11]。研究表明，Exendin-4可通过控制血糖、改善体脂分布，减少心血管并发症的发生[12]。Arakawa等[13]研究表明，Exendin-4可明显减少单核/巨噬细胞在血管壁上的聚集，并最终抑制动脉粥样斑块的形成。

本研究主要探讨Exendin-4对高脂饮食ApoE-/-小鼠脂质代谢及炎症因子表达的影响，结果发现，高脂饮食可明显加剧ApoE-/-小鼠血脂代谢紊乱，应用Exendin-4处理后，可改善TC及LDL-C水平，但对TG及HDL-C水平无明显影响，可能与实验动物的不同生理状态及给药时间长短有关。同时，通过检测小鼠主动脉及血浆中IL-6、MCP-1及VCAM-1 表达水平，发现Exendin-4干预能明显抑制炎症因子的基因及蛋白表达。

本研究结果表明，Exendin-4处理可明显改善高脂饮食ApoE-/-小鼠TC及LDL-C水平，并下调IL-6、MCP-1及VCAM-1基因及蛋白表达水平。这可能是Exendin-4稳定动脉粥样硬化斑块、抗动脉粥样硬化作用机制之一。