黄连素对高血压前期病人内皮祖细胞内皮修复能力的影响

苏 晨，吴 芳，刘 星，孙佳盼，张建宁，梁嘉文，陶 军，张小宇

高血压前期是动脉血压介于正常血压和高血压之间的状态，是指收缩压介于120～139 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒张压介于80～89 mmHg，《中国高血压防治指南2018》称之为正常血压高值，是动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的重要危险因素[1-3]。大量研究表明，高血压前期即可存在血管内皮损伤，表现为血管内皮功能障碍和内皮结构完整性的丧失[4]。血管内皮损伤是高血压及其相关ASCVD发生发展的始动环节和关键病理生理基础[5]。因此，维持血管内皮结构和功能稳态，促进血管内皮损伤的修复，对于降低高血压前期相关ASCVD的发生风险具有重要价值。

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是骨髓源性血管内皮细胞的前体，能迁移并黏附于损伤的血管内壁，定向分化为成熟内皮细胞，实现血管再内皮化，是内源性血管损伤修复的关键机制[6-7]。然而，在高血压、衰老、糖尿病等多种心血管疾病危险因素存在时，循环EPCs内皮修复能力低下[8-9]。研究发现，高血压前期病人的循环EPCs数量减少，血管内皮修复能力减退[10-11]。因此，积极寻找安全有效提高EPCs的再内皮化能力方法，促进高血压前期血管内皮损伤的修复，有望在一定程度上降低高血压及其相关ASCVD的发生风险。

黄连素是一种从传统中草药“黄连”中提取的异喹啉类生物碱，又名为“小檗碱”，长期在临床上用于治疗胃肠道感染和腹泻[12-13]。近年来，越来越多的研究证实黄连素具有改善内皮功能、保护血管、抗氧化等作用[14-15]。本课题组前期研究发现，黄连素干预可以上调健康志愿者循环EPCs的数量和功能活性，改善内皮功能[16-17]。趋化因子受体 4(chemokine receptor 4，CXCR4)目前被认为在EPCs的归巢和损伤内皮的再内皮化中发挥重要作用[18]。课题组前期研究发现高血压病病人EPCs的功能下降与CXCR4的下调有关[19]。黄连素是否能改善高血压前期病人EPCs内皮修复能力，及其是否与CXCR4相关尚不清楚。因此，本研究旨在探讨黄连素对高血压前期病人EPCs的内皮修复能力的影响及其可能的机制，为黄连素的临床应用提供新的实验依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 初次诊断为高血压前期(诊室血压：收缩压120 ～139 mmHg和/或舒张压80～89 mmHg)且未服用任何药物的病人10例，均为男性，平均血压130.5/78.6 mmHg；年龄30～60(46.6±5.6)岁；不伴有其他心血管危险因素。本研究通过中山大学附属第一医院伦理委员会批准，所有入组研究对象知情同意并签署知情同意书。

1.2 EPCs分离和培养 抽取高血压前期病人30 mL外周静脉血，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral mononuclear cells，PBMNCs)，并重悬于含20%胎牛血清及配套生长因子(EGM-2)的内皮细胞培养基(EBM-2)中，接种于细胞培养板，置于含5%CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养；每3 d更换1次新鲜培养基；于倒置相差显微镜下连续动态观察细胞形态变化。培养至7 d左右的贴壁细胞即为实验所用的EPCs。

1.3 EPCs的鉴定 取培养7 d的 EPCs，采用免疫荧光染色法和流式细胞技术进行鉴定。DiI-ac-LDL(美国Invitrogen公司)/FITC-lectin(美国Sigma公司)染色双阳性鉴定为EPCs。流式细胞技术通过测定EPCs表面CD34、KDR、CD31(美国BD公司)表达鉴定EPCs。

1.4 黄连素预处理 黄连素原粉(美国圣地亚哥ALEXIS BIOCHEMICALS)溶于溶剂(50%甲醇和50%双蒸水)，加入培养基后终浓度为2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，保证最终溶剂在培养基中浓度<1%。不同浓度黄连素预处理EPCs 8 h，用于后续实验。

1.5 EPCs迁移功能实验 将培养 7 d的 EPCs用0.25%胰酶消化，重悬于不含血清的内皮细胞培养基(EBM-2)中并进行细胞计数，采用Transwell法检测EPCs的迁移功能。24孔板中加入 500 μL EBM-2 培养基及100 ng/mL SDF-1后置入改良Boyden小室，将2×104个EPCs加入改良Boyden小室上室。24孔板置于含5%CO2、37 ℃孵箱中培养24 h，取走改良Boyden小室，4%多聚甲醛固定后用DAPI对细胞进行染色，倒置荧光显微镜下取5个视野观察并计数24孔板中的细胞数。

1.6 EPCs黏附功能实验 将用1 ng/mL肿瘤坏死因子-α(TNF-α)预处理12 h的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)接种于六孔板中，细胞密度为2×105/mL，于37 ℃培养箱中培养48 h，EPCs消化重悬后用CellTracker-Dil荧光探针(美国ThermoFisher公司)进行孵育，并调整细胞密度至1×105/mL，加入上述HUVECs中，于37 ℃培养箱中孵育3 h，吸去未贴壁的细胞，4%多聚甲醛固定后用DAPI进行染色，倒置荧光显微镜下观察并计算黏附于HUVECs的EPCs数量。

1.7 Western Blot实验 采用 Western Blot 检测不同浓度黄连素处理后CXCR4的表达水平。培养7 d的 EPCs 经预冷磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后，用细胞裂解液于冰上裂解30 min，裂解产物离心(12 000 r/min离心20 min)后进行蛋白含量测定(BCA法)。取30 μg蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜，用CXCR4抗体[CXCR4(1∶1 000)单克隆抗体，购自Abcam公司]识别结合，以相应的二抗和Bio-Rad凝胶成像仪检测CXCR4蛋白表达。

1.8 颈动脉内皮损伤模型的建立和EPCs再内皮化能力的检测 颈动脉内皮损伤模型的建立参照既往已发表的文献[18]。取8～10周龄雄性BALB/c-nu/nu裸鼠，体重约20 g，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，体视显微镜下分离颈总动脉及颈外动脉，采用直径0.36 mm的冠状动脉介入导丝在左颈总动脉内旋转并来回推送3次，损伤颈总动脉内皮。建模成功后经尾静脉注入高血压前期病人未处理和5.0 μmol/L 黄连素预处理的 EPCs。3 d后经尾静脉注射伊文思蓝染色液(evans blue)，取出颈总动脉，将动脉条用生理盐水冲洗干净后纵向切开内膜朝上置于载玻片上，正置显微镜拍照观察再内皮化情况，内皮缺失处被伊文思蓝染色液 染成蓝色，内皮完整部位不着色，利用Image J软件对染色区域行定量分析。

1.9 Western Blot蛋白测定 采用 Western Blot 检测不同浓度黄连素处理后CXCR4蛋白的表达情况。 培养7 d EPCs 经预冷的PBS洗涤后，用细胞裂解液于冰上裂解 30 min。将全细胞裂解产物离心(12 000 r/min离心20 min)后进行蛋白含量测定。取30 μg蛋白进行 SDS-PAGE并转膜，用CXCR4相应的特异性一抗[CXCR4(1∶1 000)单克隆抗体，购自Abcam公司]识别结合，以相应的荧光二抗和ECF蛋白印迹分析仪检测CXCR4蛋白表达。

1.10 统计学处理 所有统计分析采用SPSS 22.0统计软件进行，使用GraphPad Prism 8软件绘制统计图。两组间比较采用独立样本t检验，单因素方差分析(ANOVA)进行多组间差异分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高血压前期病人EPCs的免疫荧光鉴定和流式细胞技术鉴定 培养7 d后，荧光显微镜下可以观察到DiI-ac-LDL(红)和FITC-UEA-1(绿)双阳性的细胞，即培养的EPCs，蓝色：核DAPI染色(见图1A)。培养7 d的细胞经流式细胞仪进行细胞表型检测，结果：CD34(45.3±5.2)%，CD31(91.4±6.1)%，KDR(85.8±6.6)%，与本课题组和前期文献报道[20-21]一致，鉴定为 EPCs(见图1B)。

图1 EPCs的免疫荧光及流式细胞鉴定

2.2 黄连素对高血压前期病人EPCs迁移功能的影响 以不同浓度黄连素预处理高血压前期病人EPCs 8 h，与对照组比较，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的黄连素预处理可明显增加高血压前期病人EPCs的迁移能力(P<0.05)，其中5 μmol/L组效果最为明显。详见图2。

与对照组比较，*P<0.05，n=6

2.3 黄连素对高血压前期病人EPCs黏附功能的影响 以不同浓度黄连素预处理高血压前期病人EPCs 8 h，与对照组比较，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的黄连素预处理可明显增加高血压前期病人早期EPCs的黏附能力(P<0.05)，其中5 μmol/L组效果最为明显。详见图3。

与对照组比较，*P<0.05，n=6

2.4 黄连素对高血压前期病人EPCs血管内皮修复能力的影响 建立裸鼠颈动脉内皮拉脱损伤模型，移植未处理和5 μmol/L黄连素预处理的高血压前期病人EPCs至颈动脉内皮拉脱损伤模型裸鼠体内，与未处理组比较，5 μmol/L黄连素预处理可明显提高EPCs的在体再内皮化能力(P<0.05)。详见图4。

与对照组比较，*P<0.05，n=6

2.5 黄连素对高血压前期病人EPCs的CXCR4蛋白表达影响 以终浓度为2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L黄连素预处理高血压前期病人EPCs 8 h后，Western Blot 检测 EPCs 表面 CXCR4蛋白表达，结果显示黄连素预处理可增加高血压前期病人EPCs 的CXCR4蛋白表达(P<0.05)，其中5 μmol/L最为明显，且CXCR4的增多趋势与黄连素对EPCs的迁移和黏附的影响一致。详见图5。

与对照组比较，*P<0.05，n=6

3 讨 论

研究发现高血压前期病人存在着EPCs数量和功能下降，这可能是导致高血压前期病人血管内皮修复能力下降、血管内皮损伤的细胞生物学机制之一[22-24]。因此寻找安全有效上调EPCs的再内皮化能力的方法，是高血压前期血管损伤修复的重要策略，对于减少高血压前期病人远期进展为高血压及其相关血管疾病有重要意义。

黄连素自传统中药黄连中提取，在临床上长期用于治疗肠道感染和腹泻，大量的研究证实黄连素具有降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化相关炎症等作用，在心脑血管疾病治疗领域显示出良好的应用前景[13，25-27]。但黄连素是否能改善高血压前期病人EPCs的内皮修复能力及其相关机制尚不清楚。

本研究招募初诊断未经药物治疗的高血压前期病人10例，探讨了黄连素对高血压前期病人EPCs体外迁移、黏附功能以及在体再内皮化能力的影响。本研究结果发现，与对照组相比，黄连素预处理后高血压前期病人EPCs体外迁移和黏附功能明显增强。同时，通过构建裸鼠颈动脉内皮拉脱损伤模型评价EPCs的再内皮化能力，结果显示经黄连素预处理后的高血压前期病人EPCs修复血管内皮损伤的能力明显改善。

国内外以及课题组前期的研究发现CXCR4在调控EPCs的归巢和再内皮化能力中发挥重要作用[18，21，28]。为了进一步探讨黄连素改善高血压前期病人EPCs血管内皮修复能力的可能分子机制，本研究对黄连素处理后高血压前期病人EPCs的CXCR4蛋白表达进行检测，结果显示不同浓度的黄连素处理后，EPCs表面的CXCR4蛋白表达明显上调，提示黄连素改善高血压前期EPCs的内皮修复能力可能与促进CXCR4的表达有关。

本研究也存在一定局限性，首先仅在体外细胞实验和动物实验中观察了黄连素对高血压前期病人EPCs内皮修复能力的影响，后续有待临床研究进一步证实黄连素对高血压前期病人的血管保护作用。其次对于黄连素改善高血压前期病人EPCs修复能力的机制探讨，仅测定了黄连素对CXCR4蛋白表达的影响，未进行进一步深入的探讨。

综上所述，本研究显示，黄连素可以改善高血压前期病人外周血EPCs的体外迁移和黏附功能以及体内再内皮化能力，CXCR4可能参与了黄连素对高血压前期EPCs内皮修复能力的影响。为黄连素改善高血压前期EPCs血管损伤修复能力提供了新的实验依据，为进一步发挥黄连素在高血压及其ASCVD防治中的作用提供了新的证据。有关的临床研究及具体机制仍有待进一步的探索。