哮喘患者IL-4基因单核苷酸多态性的病例对照研究

史喜玉 孙金霞 马桂芳 杨李 潘梦丹

摘  要：目的  分析过敏性哮喘（简称哮喘）患者IL-4的表达及IL-4基因单核苷酸多态性（SNP）与哮喘遗传易感性的关系。方法  应用ELISA法检测67例过敏性哮喘患者和85例对照组的血清中IL-4的表达情况，采用测序的方法检测两组中IL-4基因单核苷酸多态性（SNP）rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250位点的基因分型情况，并进行统计学分析。结果  实验组患者血清IL-4的表达增高，P<0.05;4个SNP各基因型在实验组和对照组中没有明显差异，P>0.05。结论  患者血清中IL-4的表达增高，rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250多态性与IL-4的表达增高没有明显关联。

关键词：哮喘  IL-4  ELISA  SNP  测序

中图分类号：R562.25   文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2019）10（c）-0218-03

过敏性哮喘是一种严重的过敏性疾病，是最常见慢性病之一。它的特点是气管支气管对多重刺激的反应性增加，各种炎症细胞特别是嗜酸性粒细胞浸润增加，气道上皮细胞损伤、气道平滑肌肥厚，且血清总IgE升高。哮喘往往在夜间加剧，可进展为严重的气流阻塞、呼吸急促、呼吸困难和吸氧不足。如不及时治疗，会发生严重的后果，如缺氧癫痫发作，呼吸衰竭，甚至死亡[1]，它也是当今世界上最常见的慢性气道炎症性疾病。流行病学研究表明，全世界范围内呼吸道过敏的患病率高达15%～30%[1]，哮喘影响了3.5%～20%的人群[2]。

家系和双子研究显示哮喘的发病具有家族聚集性和明显的遗传倾向[3]，其遗传度可达60%～80%。IL-4是Th2细胞分泌的，常见哮喘患者IL-4表达增高。目前国际上有多篇文献报道IL-4的单核苷酸多态性（SNP）和哮喘的相关研究，但结果存在分歧。该研究设计对照病例研究，挑选IL-4基因的启动子区rs2243250（-589T/C）和rs2227284、 rs2070874、rs4986964四个SNP位点进行分析研究，探讨IL-4基因多态性多哮喘遗传易感性的影响。

1  材料与方法

1.1 材料

研究材料为哮喘患者或正常对照外周血，取自盐城周边地区人群，病例组67例，平均年龄43.2±16.27，患者符合2009年中华医学会呼吸病学会哮喘学组制定的诊断标准。正常对照组85例，平均年龄42.97±19.86，为同期健康體检人员，无哮喘史，无过敏史。

1.2 方法

1.2.1 提取基因组DNA

每例全血3～5mL，3000rpm，10min分离上清，血清转移至离心管，-20℃储存备用。剩余血细胞，采用全血DNA提取试剂盒（三博远志，离心柱型SG012）提取标本血细胞DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，-20℃储存备用。

1.2.2 ELISA法检测血清IL-4的表达

每孔加100?L实验血清，密封并室温下孵化2h;加入二抗，密封并室温下培养1h;洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。加入生物素化抗体工作液100?L/孔，密封并室温下孵化60min;洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。加入酶结合工作液100?L/孔，用封板胶纸封住反应孔，避光室温孵育20min。洗板5次，最后一次置厚吸水纸上拍干。加入显色剂TMB100?L/孔，避光室温孵育20min;加入终止液50?L/孔，混匀后，用酶标仪（450nm，Bio-Rad iMark） 即刻测定光密度（OD）值，测量OD450，并分析数据。应用SPSS 19.0统计软件对数据进行处理。

1.2.3 设计引物

IL-4基因4个单核苷酸多态性SNP位点rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250位点，设计相应的引物，交由上海生工生物有限公司合成引物。

1.2.4 PCR反应进行待测位点扩增

PCR反应体系为：模板1μL，引物F1μL，引物R1μL，10mMdNTP1μL，TaqBuffer5μL，25mMMgCl25μL，5U/μLTaq酶l0.5μL，水35.5μL。PCR反应条件为预变性95℃，3min，变性94℃，30s，退火55℃～60℃，35s;延伸72℃，40～50s，修复延伸72℃，循环35次。最后1%琼脂糖电泳，150V、100m、A20min电泳观察。采用PCR产物纯化回收试剂盒（生工SK1141），然后进行基因测序，鉴定位点的基因型。

1.3 统计学分析

将病例组和对照组基因型频数进行哈代-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验，之后进行采用SPSS 16.0软件进行数据分析。所有的统计检验均为双侧概率检验，P<0.05被认为有统计学意义。

2  结果

2.1 DNA提取后电泳结果

收集哮喘患者及正常人体检血液标本，分离血清，血细胞。血清至于离心管中，-20℃保存。剩余血细胞，采用全血DNA提取试剂盒提取标本血细胞DNA，电泳鉴定见图1。

2.2 ELISA法检测患者及对照组血清IL-4的表达

ELISA法检测67例患者及85例对照IL-4的蛋白表达，结果见表1。实验组IL-4的表达值为（0.75±0.19）pg/mL，对照组表达值为（0.39±0.13）pg/mL，P<0.05。

2.3 IL-4基因SNP筛选及测序鉴定鉴定

根据rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250位点的DNA序列，设计相应的引物，结果见表2。之后进行PCR反应，电泳验证后，用PCR产物纯化回收试剂盒（生工SK1141），测序并分析（见表3）。在4个SNP位点在实验组和对照组中无明显差异，P>0.05。

3  讨论

基因多态性是指在人群中个体间基因的核苷酸序列存在差异，即人类染色体的某个位点上单个核苷酸变异，且在人群的发生频率超过1%，称为单核苷酸多态性（SNPs）。人类基因组中SNP数量众多，平均每300～1000个碱基中就存在一个SNP。由于SNP分布广泛并且相对稳定，是人类个体差异主要的分子标记，因此，常用于反应个体表型差异、不同个体对疾病易感性以及不同个体对药物敏感性的研究[4]。

哮喘的主要免疫特征是过度的Th2反应的Th1/Th2平衡紊乱作为重要的Th2因子，IL-4可以直接促进IgE合成，因此在哮喘的病理生理过程中扮演重要角色[5]。

该研究通过病例对照研究，发现患者血清IL-4的表达增高，通过检测IL-4的4个多态性位点的基因型，发现在病例和对照中无明显差异。但此次研究样本量偏少，频率低的基因位点检测结果可能有偏颇，扩大样本量能更好地反映实际情况。

参考文献

[1] 孙金霞，周鹰，杨李，等.粉尘螨变应原Der f Mal f 6的克隆、表达及生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志，2013，8（6）：530-534.

[2] 孙金霞，崔玉宝.哮喘的遗传学研究进展[J].醫学综述，2014，20（1）：3-7.

[3] 杨李，周鹰，王运刚，等.粉尘螨变应原第1组分原核表达质粒pCold-TF-Der f 1构建及鉴定[J].中国媒介生物学及控制杂志，2012，23（4）：289-291.

[4] DA， Srinivasan M， Egholm M. The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequeneing[J].Nature，2008，452（7189）：872-876.

[5] EI Biaze M，Boniface S，Koscher V，et al. T cell activation， from atopy to asthma： more a paradox than a paradigm[J].Allergy，2003，58（9）：844-853.