北方三地6个叶用银杏无性系生长生理选育研究

路 鑫，周伟伟，吕良贺，赵 辉，周婷婷，王改萍.2

（1.南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014）

银杏Ginkgo Biloba是我国特有的多用途生态经济树种，其叶、花、果、材均可利用，同时具有极佳的观赏价值[1-3]。其叶片内部还含有其他一些有机化合物，如有机酸、氨基酸、甾类等[4]。目前，国内在优良品种选育方面有所研究[5-7]，但对叶用银杏区域化选育研究尚未深入，祝遵凌[8]等对黄叶银杏进行了区域化试验，但局限于对叶色、观赏价值的研究。叶用林的大面积种植更多采用播种繁殖，而嫁接繁殖现象尚未引起人们的足够重视[9]。本研究通过对郁万文[10]于2008年选育于邳州，南京林业大学当地优良叶用银杏无性系枝叶生长生理指标的研究，比较不同试验地、不同无性系间生长生理差异，选择丰产、生理指标优的无性系，并综合比较3 地叶用银杏繁育的可能性，为叶用银杏嫁接选育工作提供指导，并为叶用银杏新品种确定提供基础[11]。

1 试验地概况

邳州市位于江苏省徐州市东北部，地理坐标为117°35′～118°17′ E，34°04′～34°17′ N，界于黄、淮河之间，属半湿润暖温带季风气候，四季分明，日照和雨量充足，年平均气温13.9 ℃，日照2 350 h，降水量903.6 mm，无霜期211 d。土壤分为潮土、棕壤土、褐土、砂礓黑土和水稻土5个土类，其中潮土为主要土壤类型。

唐山市滦南县地处118°8′～118°53′ E、39°～ 39°38′ N 之间，属暖温带半湿润大陆性季风性气候。年平均气温10.6 ℃，常年降水量658 mm，年均日照2 853 h，无霜期186 d。主要土壤类型为草甸褐土、水稻土、潮土、风沙土等土壤类型。

甘肃省金昌市，位于101°04′35″～ 102°43′40″ E，37°47′10″～39°00′30″ N。金昌属大陆性温带干旱气候，年平均气温7 ℃，金昌属多日照区，年平均日照总时数2 981.6 h，年平均降水量139.8 mm，无霜期140 d。主要土壤类型为高山草甸土、灰褐土、黑钙土、栗钙土、风沙土。

2 材料与方法

2.1 试验设计

试验采用完全随机区组设计，用高0.5～ 0.8 m、地径1.5±0.2 cm 的3年生实生苗（2016年由邳州移栽各地的梅核品种）作砧木，定植株行距为1 m×1 m。2017年3月采集优株枝条（当年生木质化营养枝，直径1.0±0.1 cm，蜡封保存），6 个无性系各嫁接60～90 株，分别为13#、16#、27#、大佛指、叶丰、大花穗。4月中旬采用劈接法嫁接，每根砧木嫁接1 根接穗。嫁接后各试验地水肥管理条件均相同。

2.2 样品采集

待嫁接株生长稳定一年后于2018年8月生长季采集各试验地生长状况良好、健康无病虫害嫁接株的上、中、下3 个部位各10 片叶片，各区组作为3个重复，并用干冰保鲜带回实验室进行处理，并选取部分样品烘干用于叶片元素含量测定。

2.3 试验方法

2.3.1 嫁接株生长指标

于2018年6月及10月分别到3 地测量不同无性系接穗着生侧枝长度、粗度，并计算差值作为侧枝生长量，于8月对单株叶片数、侧枝叶芽节点数进行计数，并采集叶片。选取试验材料上、中、下各5 片叶片测定叶长、叶宽、叶厚，并用Photoshop 测定各材料叶面积，用烘干打孔法测定比叶面积及含水率，并得出单株叶干质量。

节间长=侧枝长/侧枝叶芽节点数。

2.3.2 叶片生理指标

部分鲜叶放置于超低温冰箱-70 ℃储存，用于可溶性糖、可溶性蛋白质、叶绿素质量分数测定，以上试验重复3 次。

可溶性糖质量分数的测定采用蒽酮比色法，可溶性蛋白质量分数测定采用考马斯亮蓝G-250法，叶绿素质量分数测定采用分光光度法，浸提液选用95%乙醇，以上5 种指标的测定均参照文献[12]中的方法，并进行适当改进。

2.3.3 叶片氮磷钾元素含量

叶片全氮、全磷、全钾经H2SO4-H2O2消煮，全氮用凯式定氮法测定，全磷用钼锑抗比色法，全钾用火焰光度法[13]。

2.4 数据处理

利用Excel2016 对各指标数据进行记录计算（保留两位小数），用SPSS19.0 对数据进行方差分析、多重比较与主成分分析[14]。

3 结果与分析

3.1 枝叶生长指标情况

3.1.1 枝叶生长指标方差分析

为了解无性系种类、试验地点及其互作对枝叶生长指标的影响，对其进行方差分析。分析结果见表1。

方差分析结果表明，除叶厚不同地点间差异显著外，其余生长指标不同试验地间都呈极显著差异，表明试验地是影响银杏嫁接株生长发育的重要条件，试验地的选择对生长发育具有重要影响。

无性系种类对无性系生长发育影响表现为：叶厚、叶干质量不同无性系间差异显著，叶长不同无性系间差异不显著，其余指标无性系间差异极显著。

试验地与无性系种类的互作效应显示，除叶长、叶宽、叶厚、叶干质量等叶生长指标外，互作效应均表现为极显著，稳定性较差。

3.1.2 枝叶生长指标测定结果及多重比较分析

针对试验地点、试验材料及其互作影响显著的枝叶产量指标，分别统计其在各试验地、各试验材料性状的平均值，并进行多重比较分析，结果见表2。

表1 各无性系生长指标方差分析Table1 Analysis of variance of growth indicators between different clones in different tested areas

表2 试验地间枝叶生长指标情况及多重比较†Table2 Indicators of branch and leaf growth between trials and multiple comparisons

不同试验地间枝叶生长指标差异显著程度不同。节间长生长量邳州显著高于唐山（P＜0.05），且邳州、唐山极显著高于金昌（P＜0.01）；枝粗生长量邳州、唐山极显著大于金昌；叶宽邳州、唐山极显著高于金昌，且唐山显著高于邳州；叶厚表现，唐山极显著高于邳州，其余差异不显著；其余指标在3 个试验地间均差异极显著。当年生侧枝长生长量由大到小依次为邳州、唐山、金昌，其中唐山达到8.21 cm，为金昌的3.06 倍；其余指标由大到小均表现为唐山、邳州、金昌。

变异系数一定程度上反映了各无性系在不同生长地点性状表现的稳定性[11]。除叶形态指标外其余枝叶生长指标在不同试验地变异系数大多在20%以上，试验地间枝叶生长指标的变异幅度较大。各无性系在试验地间叶形生长指标变异幅度较小，叶质量指标变异幅度较大，枝生长指标变异幅度最大，稳定性最差（表3）。

各指标不同无性系间差异较大。节间生长量、枝长生长量、叶片数、单株叶质量4 个指标佛指最高；叶长、叶宽、叶干质量3 个指标16#最高；侧枝长与粗生长量都为叶丰表现最差，极显著低于其它生长指标高的无性系。叶长、叶宽、叶厚、叶干质量等叶片生长指标中，大佛指均显著或极显著低于其余无性系。综合分析大佛指叶片形态表现最差，16#表现最佳；侧枝生长大佛指表现最佳，叶丰表现最差。

表3 无性系间枝叶生长指标情况及多重比较†Table3 Indicators of clonal growth index and multiple comparisons

由表4数据得出，不同无性系间叶片形态指标变异系数均较小；侧枝生长量变异系数较大，稳定性较差。

表4 无性系间生长指标变异情况Table4 Variation between clones of each growth index

3.2 各无性系叶片生理指标表现

叶片生理指标是衡量无性系叶片生长的一个重要指标。叶片的相对含水量等表征植物在遭受干旱胁迫后的整体水分亏缺状况[15]，反映了植株叶片细胞的水分生理状态，主要通过对3 个试验地6 个无性系叶片生理指标的对比分析，了解不同无性系在不同环境条件下的主要营养状况，探索各无性系营养指标的稳定性及生长发育状况。银杏叶片可溶性蛋白质质量分数随着生长期提高至叶衰期[16]，本试验选择8月作为可溶性蛋白质测定时期。

3.2.1 无性系叶片生理指标方差分析

为了进一步检测叶片各生理指标在试验材料间和地点间的变化是否达到统计学的差异显著性程度，分别就地点、试验材料及其交互作用进行了双因素方差分析，得出结果见表5。

各试验材料的基础可溶性糖、可溶性蛋白质、叶绿素、叶片元素含量（碳、氮、磷、钾）均受到试验地点的极显著影响（P＜0.05），试验地是影响无性系生理指标表现的重要因素。

除叶片可溶性糖含量不同无性系间差异显著（P＜0.05）外，其余指标均呈现极显著差异。无性系种类是影响叶片生理指标表现的重要因素。

不同指标无性系种类与试验地点间的交互作用均达到极显著。

3.2.2 各无性系叶片生理指标情况及多重比较结果

为准确反映出不同试验地及无性系种类间生理指标差异状况，现对各生理指标并进行多重比较。可溶性糖含量唐山、金昌与邳州相差3.68、 7.87 mg·g-1；叶全碳、全氮、全磷、全钾含量差异极显著。除叶全碳、全钾、比叶面积外，其余指标均为金昌含量最低。除叶绿素和比叶面积外，其余指标3 地间均呈现极显著差异。

表5 各无性系在不同试验地生理指标方差分析Table5 Analysis of variance of physiological indicators of different clones in different experimental sites

表6为不同试验地无性系生理指标及多重比较结果。由表得出，叶绿素含量金昌与唐山差异极显著，相差0.08 mg·g-1；比叶面积邳州与金昌间差异极显著，相差89.11 cm2·g-1；可溶性蛋白质含量金昌、唐山分别达到邳州的80%、86.5%；

表6 试验地间枝叶生理指标情况及多重比较Table6 Physiological indicators of branches and leaves between experimental sites and multiple comparisons

无性系间不同生理指标指标间差异显著性互不相同（表7）。可溶性蛋白质含量叶丰最高，达到1.69 mg·g-1，与佛指显著高于其余无性系；可溶性糖含量13#最高，达到33.08 mg·g-1；叶绿素含量花穗极显著高于其余无性系（1 mg·g-1）；叶全碳含量不同无性系间差异极显著，其中佛指最高（492.20 g·kg-1）；叶全氮16#极显著高于其余无性系，为21.76 g·kg-1；叶全磷13#高于其余无性系，为4.57 g·kg-1；叶全钾由高到低为13#、16#、叶丰、27#、大佛指、大花穗，但无性系间差异不显著。

除叶绿素、叶全钾变异系数＞10%外，其余均未达到10%，无性系间生理指标较稳定（表8）。

表7 无性系间叶片生理指标情况及多重比较Table7 Leaf physiological indexes and multiple comparisons of different clones

表8 无性系间生理指标变异情况Table8 Variation of physiological indexes between clones

3.3 各无性系叶片生长生理指标主成分分析

由于各无性系在不同试验地间生长生理指标较多，无法直观比较不同无性系在各试验地间生长营养表现，因此选用主成分分析方法对14 项指标进行降维处理（表9），得到综合分值[17]。前5个主成分的累计贡献率达到84.618%，说明前5 个主成分能代表全部资源近85%的信息。

表9 主成分特征值、贡献率及累计贡献率Table9 Principal component eigenvalue,contribution rate,and cumulative contribution rate

据主成分载荷矩阵和特征值计算出前4 个主成分的特征向量，得出4 个主成分为：

Y1=0.164X1+0.224X2+0.035X3-0.282X4-0.019X5+ 0.347X6+0.250X7-0.358X8+0.203X9+0.288X10+ 0.344X11+0.332X12+0.259X13+0.333X14；

Y2=0.380X1+0.134X2-0.316X3-0.004X4+0.340X5- 0.032X6-0.319X7+0.043X8+0.438X9+0.338X10- 0.053X11+0.070X12-0.424X13-0.155X14；

Y3=0.238X1+0.481X2+0.478X3+0.004X4+0.486X5+ 0.130X6-0.195X7-0.084X8-0.159X9-0.192X10-

0.139X11-0.252X12+0.199X13-0.037X14；Y4=-0.054X1+0.161X2+0.598X3-0.141X4-0.488X5- 0.235X6-0.212X7+0.136X8+0.369X9+0.197X10+ 0.037X11+0.070X12-0.011X13-0.236X14；

Y5=-0.058X1+0.173X2+0.643X3-0.152X4-0.524X5- 0.252X6-0.228X7+0.146X8+0.396X9+0.211X10+ 0.040X11+0.075X12-0.012X13-0.253X14。

不同主成分贡献率作为权重，计算主成分综合模型得分为：

Y=(48.954Y1+14.425Y2+8.532Y3+6.809Y4+5.898Y5)/ 84.618。

上述式中，X1～X14分别表示可溶性蛋白质、可溶性糖、叶绿素含量、比叶面积、叶全碳、全氮、全磷、全钾、节间长、侧枝长、侧枝粗生长量、叶片数、叶面积、单叶干质量。

根据主成分表达式，第一主成分以X6最大，X11、X12、X14较大，表示叶片生长因子；第二主成分以X9最大，X1、X5、X10较大，表示侧枝生长因子；第三主成分以X5最大，X2、X3较大，表示叶片营养物质因子；第四主成分以X3最大，X9较大，表示叶片叶绿素因子；第五主成分以X3最大，X9较大，对第四主成分进行补充。

数据标准化处理后，主成分综合模型得分由高到低统计见表10。

根据综合主成分值，可将综合分值分为3 类。第一类为0.9～2 分，该类无性系与地点间互作效应良好，嫁接株生长营养状况良好，其中大佛指、27#分值较高；第二类为0～0.9 分，该类无性系与地点互作效应中等，试验材料生长营养状况中等；第三类为＜0 分，该类无性系在该试验点生长及营养状况差，生长效益低。

大佛指及27#在邳州、唐山生长营养状况均较好，13#、16#在邳州生长状况相比唐山较优，而大花穗、叶丰则在唐山生长状况优于邳州。另外，金昌的所有无性系生长及营养状况均较差，说明金昌不适于该类叶用银杏无性系的生长。

表10 主成分值和综合分数值排名Table10 Principal component values and comprehensive scores

4 结论与讨论

1）试验材料枝叶生长及生理指标受试验地点影响较大，变异程度较大，试验地点的选取对试验材料生长及营养情况影响较大；

2）部分无性系间枝叶生长生理指标差异较大，但相对试验地间差异较小，大佛指叶片形态表现最差，16#表现最佳；侧枝生长大佛指表现最佳，叶丰表现最差。且27#、佛指可溶性糖、可溶性蛋白质含量相对其余无性系较高，抗逆性较其他无性系较强，有利于叶片生长，其叶生长指标较高于其余无性系。

3）大佛指及27#在邳州、唐山生长生理状况优于其余无性系，适合在邳州唐山进行叶用繁育，金昌各无性系生长状况较差，可能由于金昌当地气候条件不适于银杏生长，且可能由于金昌土壤养分情况较差，无性系叶片氮磷元素含量较低，导致参与合成营养物质的基础物质含量较低，金昌无性系可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素含量较低，且可溶性糖、蛋白质与植物抗逆性相关，导致金昌嫁接株抗逆性差，光合作用效果差。向类似地区引种应注意水肥管理及改善环境条件。

本试验中6 个无性系其原产地地理位置与唐山、邳州距离较近，气候条件相似，与金昌环境条件差别较大，在试验地选取上存在一定不足；且由于试验周期较短，导致部分嫁接株尚未完全适应，部分性状并未稳定，后期应当继续进行相关试验，以得到更为准确的结论。在后续研究中，应对试验地气候及土壤对无性系生长生理影响效应进行研究，并进行连续多年的稳定性状调查测定。