金花茶组植物叶解剖结构特征与抗旱性的关系

王 坤，韦晓娟，李宝财，李开祥，马锦林

（广西林业科学研究院 广西特色经济林培育与利用重点实验室，广西 南宁 530002）

金花茶组植物Camelliasect.Chrysantha是世界上稀有的珍稀植物[1]，因其金黄花朵在山茶科植物中别具一格，观赏性极高，具有很大的市场开发潜力[2-3]。二十世纪六十年代初被首次发现，引起了各个领域专家的关注，其有“植物界的大熊猫”“植物活化石”等美名[1]。金花茶适宜生长在温暖、荫凉和潮湿环境，目前为林下经济发展的重要树种[4]。

抗旱性是植物对自然界干旱环境适应的一种遗传特性，由多基因控制[5]。植物在生理生化方面的差异性是长期适应生长环境的变异结果，短期内生长环境因子的改变不会影响其生理生化指标[6]，叶片作为与外界环境紧密接触的重要器官，主管植物的光合作用和呼吸作用，其组织结构最易受到环境因子的影响，同时也最能体现植物对环境条件的适应性，因此，在植物的抗旱性研究中，叶解剖结构特征常被作为重要的参考指标。目前关于叶片形态特征与抗逆性的关系已受到很多学者关注[7-9]，研究表明，抗旱性较强的植物品种具有叶片厚度和栅栏组织厚度较大、栅栏组织厚度/海绵组织厚度比值高、气孔密度高等特性[7-9]。目前对于金花茶的研究多为栽培繁育[10]、活性成分分析[11-12]、光合特性[13-14]，及环境胁迫对金花茶幼苗的影响[15-16]等方面，对不同金花茶品种的叶片解剖结构对比及抗旱性分析未见文献记载，因此，本研究选取广西本地金花茶与越南引种金花茶共8 个品种，对其叶解剖结构进行观测，综合评价其抗旱性，为金花茶的进一步引种栽培提供理论依据，并通过相关培育技术的引进，补充我国金花茶种质资源，丰富新品种繁育材料，建立金花茶高效栽培技术和模式。

1 材料与方法

1.1 试验材料

8 种金花茶组植物栽培在广西壮族自治区林业科学研究院油茶种质资源库山茶苗木培育基地，3年生扦插苗。其中4 种越南金花茶（塔姆岛金花茶、箱田金花茶、罗斯曼金花茶、多毛金花茶）于2015年7月引自越南塔姆岛国家自然保护区，4 种广西本地金花茶（普通金花茶、显脉金花茶、凹脉金花茶、小花金花茶）来自广西林科院油茶种质资源库山茶苗木培育基地（表1）。于2017年6月30日采集8 种金花茶植物2年生叶进行试验。

表1 试验材料信息Table1 Information of experimental materials

1.2 试验方法

1.2.1 解剖学结构分析

避开叶片的主脉和边缘，取中间部位徒手用双面刀片进行组织切片，用光学显微镜（Leica DM 2500，Germany）对叶片横切的切片进行观察，横切时避开主脉，对叶片各解剖结构特征值（叶片厚度、上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮）进行测定。

每个品种选取5 张叶片，每个叶片选取6 个视野，在每片叶片相同位置的主脉，用双面刀片对其进行徒手切片，选取完整、薄厚适中的切片，甲基蓝染色后晾干，制成临时装片，用显微镜（Leica DM 2500，Germany）在40 倍镜下进行观测，并选取清晰视野拍摄图片。用ImageJ 测量导管的长轴和短轴直径，其中导管直径计算公式为：

式（1）中，Vd 为导管直径，a及b分别指导管的长短轴半径。

1.2.2 气孔特征的观测

使用指甲油印记法，用无色指甲油涂在叶片的下表皮中部，等指甲油干后，用透明胶带将指甲油撕下，直接贴在载玻片上，然后用显微镜（Leica DM 2500，Germany）在40 倍镜下进行观测并拍摄图片。用ImageJ 图形处理软件处理图片，统计视野内的所有气孔个数，测量保卫细胞纵轴长和横轴长。计算气孔密度（SD）及气孔指数（SI）。气孔指数=气孔密度/（气孔密度+表皮细胞密度）。

1.3 数据处理

利用Excel 2010 软件对试验结果进行初步分析，利用SPSS 19.0 统计进行Duncan 多重比较、方差分析和主成分分析，采用模糊数学的隶属函数法对金花茶组植物叶片的各个参数指标进行综合评价。隶属函数值的计算公式为[17]：

式（2）中xi为指标测定值，xmax、xmin为所有测定材料某一指标的最大值和最小值。若某一指标与植物抗旱性之间呈负相关，则利用反隶属函数进行计算，其计算公式为：

2 结果与分析

2.1 显微结构对比分析

从表2可见，塔姆岛金花茶的叶片厚度最大为422.95 μm，与其他金花茶叶片厚度具有显著差异性（P＜0.05），普通金花茶和显脉金花茶叶片厚度仅次于塔姆岛金花茶，分别为323.87、329.41 μm，凹脉金花茶的叶片厚度最低，为189.20 μm，比塔姆岛金花茶降低了55.27%，相比塔姆岛金花茶，罗斯曼金花茶、箱田金花茶、多毛金花茶、小花金花茶的叶片厚度，分别降低了37.03%、37.10%、39.85%、34.21%。上表皮厚度和小表皮厚度的数据显示，普通金花茶的上表皮和下表皮厚度值最大，分别为34.27 和26.25 μm，凹脉金花茶上下表皮值最小，比普通金花茶降低了49.49%、42.02%；4 种越南金花茶与广西本地金花茶中的小花金花茶和显脉金花茶的上下表皮细胞厚度值无明显差异性。箱田金花茶和多毛金花茶的中脉导管直径值最大，分别为30.02 和33.84μm，越南金花茶中的罗斯曼金花茶和4 种广西本地金花茶的中脉导管直径差异性不大。越南金花茶中的塔姆岛金花茶、箱田金花茶和多毛金花茶的栅栏组织层数为1 层，罗斯曼金花茶和4 种广西本地金花茶的栅栏组织层数均为2 层（图1）。

表2 8 种金花茶组植物叶解剖结构（n=30）†Table2 Anatomical structure of eight species of Camellia sect.Chrysantha leaves (n=30)

图1 8 种金花茶组植物成熟叶片横切面Fig.1 Cross section of eight species of Camellia sect.Chrysantha leaves

8 种金花茶组植物的栅栏组织厚度和海绵组织厚度数据见表3，普通金花茶的栅栏组织厚度值最大为86.97 μm，罗斯曼金花茶、箱田金花茶、小花金花茶和显脉金花茶的栅栏组织厚度值次之，分别为73.04、70.17、72.06 和73.16 μm，他们之间差异性不显著，相比普通金花茶，塔姆岛金花茶、多毛金花茶的栅栏组织厚度降低了38.12%、39.13%，凹脉金花茶的栅栏组织厚度最小，为42.06 μm。8 种金花茶组植物第一层栅栏组织高度和宽度值差异显著（P＜0.05），塔姆岛金花茶和普通金花茶的第一层栅栏组织高度值最大分别为47.55、 48.10 μm，凹脉金花茶第一层栅栏组织高度值最小，比普通金花茶降低了38.15%，箱田金花茶和多毛金花茶第一层栅栏组织宽度值最大，分别为15.19、15.82 μm，凹脉金花茶的第一层栅栏组织宽度值最小，为12.20 μm。越南金花茶中只有罗斯曼栅栏组织层数为2 层，普通金花茶的第二层栅栏组织高度值最大，为37.87 μm，凹脉金花茶的第二层栅栏组织高度值最小，为23.19 μm，其他金花茶的第二层栅栏组织高度值差异不显著（P＞0.05），凹脉金花茶的第二层栅栏组织宽度值也最小，为14.02 μm，其他金花茶组植物差异不显著（P＞0.05）。塔姆岛金花茶海绵组织厚度值最大，为319.70 μm，显脉金花茶次之，为203.48 μm，凹脉金花茶海绵组织厚度值最小，为103.42 μm，相比塔姆岛金花茶降低了67.65%，与塔姆岛金花茶相比罗斯曼金花茶、箱田金花茶、多毛金花茶、小花金花茶、普通金花茶分别 降低了52.74%、54.89%、47.62%、51.01%、44.84%，这5种金花茶之间差异不显著（P＞0.05）。通过表5可见栅栏组织厚度/海绵组织厚度的比值具有显著差异性，罗斯曼金花茶、箱田金花茶、小花金花茶、普通金花茶、凹脉金花茶的栅海比最大，在0.5 左右，塔姆岛金花茶、多毛金花茶的栅海比最小，分别为0.17、0.25。

表3 8 种金花茶组植物叶解剖结构（n=30）Table3 Anatomical structure of eight species of Camellia sect.Chrysantha leaves (n=30)

2.2 气孔特征对比分析

8 种金花茶组植物的叶片气孔发育特征见表4。气孔密度值最大的普通金花茶、塔姆岛金花茶、罗斯曼金花茶，分别为105.48、101.89、 98.20 个/mm2，最小值为小花金花茶和凹脉金花茶分别为67.29、66.17 个/mm2，具有显著差异性 （P＜0.05）。气孔纵轴长和横轴长最大值均为普通金花茶为19.21、23.91 μm，最小值均为凹脉金花茶为10.28、11.21 μm。除了凹脉金花茶，其他金花茶品种之间的气孔指数值差异不显著 （P＞0.05），凹脉金花茶气孔指数值最小为0.11，其他金花茶的气孔指数均在0.2 左右。

表4 8 种金花茶组植物气孔发育特征（n=30）Table4 Stomata growth of eight species of Camellia sect.Chrysantha leaves (n=30)

2.3 主成分分析

各主成分的得分系数矩阵、贡献率及累积贡献率见表5，我们以特征值大于1.0 为标准，得到3 个主成分，这3 个主成分的累积贡献率为90.437%，可以代表8种金花茶组植物8 个指标90.437% 的综合信息，符合我们进行主成分分析的目的。各主成分系数绝对值较大的指标可以作为评价树种抗旱性的重要依据[18]。第一主成分中叶片厚度系数最大，下表皮厚度、海绵组织厚度、气孔密度的系数次之；第二主成分中栅栏组织厚度、栅栏组织厚度/ 海绵组织厚度的系数最大；第三主成分中中脉导管直径的系数最大。因叶片厚度已经包含下表皮厚度，栅栏组织厚度、海绵组织厚度及栅栏组织厚度/海绵组织厚度3 个指标中，栅栏组织有助于减少叶片蒸腾作用，提高植物的抗旱能力，栅栏组织厚度最能体现植物的抗旱性，故选择叶片厚度、中脉导管直径、栅栏组织厚度、气孔密度作为评价抗旱性的指标。

表5 叶片解剖结构特征的主成分分析Table5 Results of a principle component analysis of leaf anatomical structures characteristics

2.4 抗旱性比较

根据主成分分析结果，运用隶属函数法[19]对叶片厚度、中脉导管直径、栅栏组织厚度、气孔密度进行计算，对8 种金花茶组植物4 项抗旱性指标的隶属函数值进行累加求平均值，结果见表6。综合评价了8 种金花茶组植物的抗旱能力，均值越大抗旱性越强，结果表明普通金花茶的抗旱性最强，凹脉金花茶的抗旱性最弱。通过隶属函数法的评价结果，抗旱性最强的3 个品种为普通金花茶、塔姆岛金花茶、多毛金花茶，隶属函数均值均在0.2以上；抗旱能力次之的4 个品种为罗斯曼金花茶、小花金花茶、显脉金花茶、箱田金花茶，均值在0.149 2～ 0.197 6；抗旱性最弱的金花茶品种为凹脉金花茶。

表6 8 种金花茶组植物4 项指标的隶属函数值及抗旱性综合评价Table6 Subordinate function values of four indices in eight species of Camellia sect.Chrysantha and comprehensive appraisals of drought resistance

3 结论与讨论

叶片解剖结构的变化与植物的生长有着重要的联系，较厚的表皮细胞和发达的栅栏组织可以通过保持植物的内部水分，更有利于植株的生长发育[20]，通过对4 种越南金花茶和4 种本地金花茶的叶解剖结构特征值进行测定后，数据表明塔姆岛金花茶的叶片厚度值最大，为422.95 μm，与其他金花茶的叶片厚度具有显著差异性（表2），普通金花茶、罗斯曼金花茶、箱田金花茶的栅栏组织厚度值最大，表明这4 种金花茶品种的植物生产力强；而凹脉金花茶的叶片厚度值和栅栏组织厚度值最小，表明其植物生产力最弱。气孔是植物叶片与外界空气交换和水分流失的重要通道，是影响植物光合和蒸腾作用的重要因素。气孔密度值越大越有利于提高光合速率，气孔小而密的植物往往光合能力更强，可以更快地响应外界的环境因子[21]，当遇到外界环境改变发生胁迫时，小的气孔可以迅速关闭以防止水分进一步丧失，而大的气孔关闭缓慢，植物易发生失水等问题，引起功能失调[22-23]。通过对4 种越南金花茶和4种广西本地金花茶叶片的气孔进行观测，结果表明，气孔密度值最大的是普通金花茶、塔姆岛金花茶、罗斯曼金花茶，分别为105.48、101.89、98.20 个/mm2，最小值为小花金花茶和凹脉金花茶分别为67.29、66.17 个/mm2，具有显著差异性 （P＜0.05）。4 种越南金花茶叶片的气孔纵轴长和横轴长普遍小于4 种本地金花茶，表明越南金花茶具有小的气孔。广西本地普通金花茶和越南金花茶品种中罗斯曼金花茶、塔姆岛金花茶、箱田金花茶的叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、气孔密度值较大，气孔较小，这些品种的金花茶叶片对光能的利用率高，更有利于保持植物内部水分，防止水分流失。而广西本地金花茶中的凹脉金花茶则表现最差，可能其光合能力最弱。

前人多采用一定的数学方法获得既定的综合数值来衡量植物的抗旱性，目前主要采用主成分分析法、隶属函数法、抗旱性指标以及模糊数学中的聚类分析和灰色关联度分析法等相关方法对植物抗旱性进行综合分析评价[6-9,24]。本研究根据主成分分析，叶片厚度、中脉导管直径、栅栏组织厚度、气孔密度可以作为反映金花茶抗旱能力的叶解剖结构特征指标，叶片厚度越厚说明植物的控水能力越强，抗旱性能越好；有学者对抗旱性较强的树种进行分析，发现其维管束排列紧密且导管直径较大，说明中脉导管直径可以作为抗旱能力强弱的重要指标；栅栏组织的作用可以减少植物叶片水分的蒸腾作用，提供其光合效率及抗旱能力；气孔越小且气孔密度越大的植株能在干旱的环境中有效地减少水分流失。说明这4 个叶解剖结构指标可以很好地反映植物的抗旱能力。通过隶属函数法综合评价了8 种金花茶组植物的抗旱能力，结果为抗旱性最强的3 个品种为普通金花茶、塔姆岛金花茶、多毛金花茶，抗旱能力最差的为凹脉金花茶。

植物的抗旱性能是长期对环境适应的综合特性结果，不仅与叶解剖结构特征有关，还依赖于其他生理生化指标，若要准确的评价金花茶的抗旱性，还需参考其水分胁迫的受害情况及胁迫后恢复能力等指标，进一步加强胁迫对不同金花茶品种的影响将是我们下一步工作的重点。