白木香良种‘热科2号’的芽接繁育①

王宇光 王 军 段瑞军 覃和业 梅文莉 戴好富

(中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室/海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室/海南省沉香工程技术研究中心 海南海口571101)

沉香药用价值较高，被广泛应用于消化、呼吸、心脑血管、风湿等疾病的治疗［1-2］。沉香还是一种香料，在中东国家，沉香精油、香水备受推崇。此外，沉香的文化收藏价值也较高。世界沉香及产品每年的贸易额达200亿元以上，且呈逐年增加之势。

白 木 香 ［Aquilariasinensis（Lour.）Spreng.］是中国生产沉香的唯一基源植物，人工规模栽培已有40 a历史，但对其遗传资源的系统评价和选育尚未开展，种苗培育所用种子大多来自栽培或野生成龄植株，种质参差不齐［3］。因此，研究沉香优良品种的选育和繁育技术具有重要的意义。种子后代为有性系，而通过组培、扦插和嫁接等方式生产的种苗为无性系，其性状不会发生分离。白木香是较难生根植物，无论组培［4-6］还是扦插［7-8］，生根率均较低，嫁接技术因可以克服生根困难，成为解决沉香种苗繁育的最佳途径［9-10］。前人已筛选和鉴定了优良白木香母树，通过嫁接可实现该母树的无性系化，经多地区种植，利用GC-MS技术分析检测所产沉香，发现嫁接无性系和母树具有相同的优良特性，即所产沉香所含的沉香特征性成分相对百分含量较高，总色酮相对百分含量平均为81.50%，其中，2-（2-苯乙基）色酮、2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮、2-［2-（3-羟基-4-甲氧基苯）乙基］色酮和2-［2-（3-甲氧基-4-羟基苯）乙基］色酮的相对百分含量之和平均为77.00%，2-（2-苯乙基）色酮和2-［2-（4-甲氧基苯）乙基］色酮的相对百分含量之和平均为51.25%，比普通白木香所产沉香相关成分的相对百分含量显著提高，具有‘奇楠’沉香的化学成分特征［11-13］。‘奇楠’沉香是业界公认的最优质沉香。因此，上述嫁接的无性系被认为是一种白木香优良无性系，将其命名为‘热科2号’，2017年获得海南省林木品种委员会认定（良种编号：琼R-ETS-AS-003-2017）。为进一步推广，开展白木香‘热科2号’嫁接苗扩大生产的研究，验证‘热科2号’在遗传上的独立性及第一代嫁接苗和母树在遗传上的一致性，避免由于某些失误导致种质间的混淆。同时，在采用第一代嫁接苗作为芽条进一步扩繁之前，采用基因组单碱基多态性 （single nucleotide polymorphisms， SNPs）技术［14-15］对‘热科2号’进行基因分型。

前人多使用枝接（穗接）扩繁白木香，即直接从野外采集自然生长的土沉香穗来进行嫁接，成活率平均为15.00%［9］。人工种植白木香植株可通过砍枝促萌管理，用1 a生枝条进行嫁接，显著提高白木香嫁接成活率，平均为56.80%（最高为84.00%）［10］。由此可见，优化砧木和芽条生长状况可提高白木香嫁接成活率。目前，尚未见芽接应用在白木香嫁接苗扩繁，但该方法在橡胶树等大规模产业化林木无性系生产上应用较为成熟，成活率也较高［16-17］，因其具备诸多优势，如对嫁接季节要求不严格，不浪费砧木，繁殖数量大，对推广良种极为有利［18］。因此，有必要开展‘热科2号’的芽接扩繁技术的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

‘热科2号’嫁接苗繁育试验地点：海南省文昌市迈号镇中国热带农业科学院基地。该地为热带气候，每年最低温高于3℃，不出现明显霜冻。

‘热科2号’第一代嫁接苗由中国热带农业科学院热带生物技术研究所2013年扩繁所得。

砧木为白木香种子苗，包括来自广东化州地区、海南中部地区（琼中）和海南南部地区（保亭）的白木香种子苗，用塑料营养袋培育，营养袋规格为17 cm×19 cm。

白木香基因组的单碱基多态性（SNP）分析由北京百迈客生物科技有限公司协助完成。

1.2 方法

1.2.1 白木香‘热科2号’SNP基因分型

参考Sun等［19］方法，通过开发白木香全基因组SNP标记，应用于白木香的分型。从广东白木香种群A取27个样本（A1，A3，A4，A7，A11，A12，A19， A20， A26， A28， A29， A30， A32， A34，A35， A37， A40， A42， A48， A51， A54， A56，A59，A60， A100， A101，A102）；海南白木香种群C取11个样本（C1～C11）；‘热科2号’母树和第一代嫁接无性系样本B取5个样本（B2，B3，B4，B5，B6），其中B6为‘热科2号’母树，B2、B3、B4、B5为‘热科2号’嫁接苗。另外，B7、B1为砧木，作为对照。样本分别为各植株叶片，置离心管于液氮中保存。样品总基因组DNA采用试剂盒（SolarBio）提取，每样品的DNA总量为1.5μg，浓度≥20ng/μL，纯度OD 260/280为 1.8～2.2。采用RsaI＋HaeIII对45个样品DNA分别酶切［20］，于 37 ℃用 Klenow fragment （3→5'exo-）（NEB）和dATP对酶切片段进行加A处理。用T4连接酶对带有A尾的酶切片段连接测序接头［21］。以连接测序接头后的DNA片段为模板，用引物（5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'，5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3'）进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后切下长度在364～414 bp片段，纯化得到SLAF标签库［19］。上机测序，分别得到各自读段［22］。根据读段序列的相似度，进行聚类，聚类到一起的读段来源于一个SLAF F标签。一个SLAF在不同样品间序列可能完全相同（没有多态性），也可能相互之间有变异（包括插入/缺失变异、单碱基变异），称为多态性SLAF序列。单碱基变异造成的SLAF多态性即为SNP。以每个SLAF标签中测序深度最高的序列类型作为参考序列，利用bwa［23］将各个样品测序得到的读段比对到参考基因组（Aquilaria agallochum基因组）（下载地址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/32033？genomeassembly id=202302） 上，并使用 GATK［24］和 samtools［25］2种方法开发SNP，以2种方法得到的SNP标记交集作为最终SNP标记数据集。

白木香种群的分型和进化关系：对所有的SNP根据完整度＞0.5，MAF＞0.05过滤。运用数学统计学方法，对45份白木香完成群体进化树分析，从基因组水平揭示不同群体之间的遗传分化关系［26］。

1.2.2‘热科2号’嫁接苗生产

‘热科2号’第一代嫁接苗按2 m×2 m行距种植在黄壤土（pH6.5）。每周采用塑料喷灌带给水1次，保持土壤湿度。每株种植时施有机肥4 kg。后续每月补施复合肥1次，10 g/株。每2个月分别用80%的代森锰锌可湿性粉剂稀释700倍液喷洒整个植株预防炭疽病，用90%的敌百虫稀释1 000倍液喷洒叶片控制黄野螟、青虫、卷叶虫等虫害。

‘热科2号’母树第一代嫁接苗于2014年6月基地种植后，2016年5月主干生长至约1.8 m高，去顶。2017年6月取1 a生枝条进行嫁接，修剪植株。新长出的枝条在较好的肥水和病虫害管理下，次年春天随着温度升高（平均温度25℃以上）进入良好的生长状态，5月后可再次用于嫁接。以后每年取芽条嫁接时对植株进行相同的修剪。

嫁接前4个月，将2.5 a生树体健壮、无病虫害的白木香种子容器苗（塑料营养袋规格为17 cm×19 cm，地径≥1.5 cm，苗高≥110 cm）移植在苗床上，株行距20 cm×20 cm，每2行留40 cm宽行道作为嫁接操作所用，并用红壤土将营养袋覆盖。每0.5个月施复合肥1次，7 g/株。经过4个月生长，可用于嫁接。

5～10月，选择1.0～1.5 a生芽条，切下包含有效芽点的芽片，去除木质部，剪成“盾形”。在砧木距地面7 cm处地径一面切成“U”，拨除砧木皮层，插入芽片，用塑料带绑紧。30 d后将绑缚解除。65 d后将嫁接成活苗的砧木锯顶，催芽。

1.2.3 对照芽条植株和砧木的培养

作为对照，部分‘热科2号’植株和海南中部地区的白木香种子苗在嫁接前6个月自然生长，即不人工给水和施肥、不使用农药。由于试验区比较干旱，所用土壤为深挖红壤土，较贫瘠，因此，芽条和砧木植株基本生长在胁迫型的环境中。

1.2.4 不同处理对嫁接成活率的影响

分别取海南琼中产的白木香种子苗3 000株（I组）、广东化州产白木香种子苗900株（II组）和海南保亭产的白木香种子苗3 000株（III组）为砧木，以‘热科2号’嫁接苗植株1.0～1.5 a生枝条为芽条，分别于2017年6月、2018年6月和2018年9月进行嫁接，I组和III组每次嫁接1 000株，II组每次嫁接300株。同时取1.2.3条件下生长的砧木和芽条分3次进行嫁接（IV组），每次砧木200株，作为对照。嫁接30 d后去除薄膜，检查嫁接的芽片是否保持绿色，如为绿色，即认定为成活。

采用Excel和SPSS 11.5统计分析软件对不同处理获得的芽片嫁接成活率进行差异显著性分析。

砧木锯顶后设置3组试验。A组：将苗床上的全部砧木植株做锯顶处理。保持土壤湿润，继续培养4个月，计算芽片的抽芽率；B组：将苗床部分嫁接成活芽片的砧木植株做锯顶处理；C组：取芽接成活的砧木植株做锯顶处理，并从营养袋底下断根，移植空地苗床，并用红壤土将营养袋覆盖。使用遮光率45%的遮阳网遮荫培养1个月后拆掉遮阳网。为了避免锯顶处理造成砧木死亡，以上锯顶的方法是从砧木苗高的35%～40%位置锯断，并用油漆涂布切口，其后通过抹掉不定芽的方式诱导嫁接成活芽片抽芽。每组处理重复3次，分别于2017年10月15日（每组100株）、2018年10月20日（每组400株）和2018年11月5日（每组400株）进行。

2 结果与分析

2.1 白木香‘热科2号’的基因分型

通过 SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing）技术共开发了328 377个SLAF标签，共得到585 503个群体SNP。通过MEGA6［26］软件，构建样品的群体进化树，如图1所示。

由图1可知，通过SNP标记，A、B、C 3个白木香种群能很好地分开，而且A种群27个个体被分为4个亚群，表现出丰富的多样性。B种群为白木香‘热科2号’第一代嫁接苗和母树，被集聚在同一特异分支上，很好地与其它种群（A、C种群）分开，说明是一个群体遗传上相对独立的品系。B1、B7为砧木，作为对照，也能与白木香优良嫁接无性系‘热科2号’很好地分开，从而说明利用SNP分型的准确性。比较A、B、C3个白木香种群不同个体间的遗传距离，发现B种群个体间的遗传距离最短。A、C种群的不同个体为同一家系或自然群体样品，遗传距离比作为嫁接无性系的B种群个体间的遗传距离长，反映了样品的实际情况。

图1 白木香‘热科2号’系统进化树

2.2 不同方法培养的芽条和砧木对芽片嫁接成活率的影响

由表1可知，I、II、III组芽片嫁接成活率比较高，平均达90.31%，IV组芽片嫁接成活率比较低，平均为25.50%。I、II、III组和IV组间的芽片嫁接成活率差异显著，可见芽条和砧木的培养方法对芽接成活率有重要影响。可能是由于I、II、III组芽条和砧木在良好的水肥及充足的光照条件，严格的病虫害控制下培养，处在良好的生长状态，形成层较厚，易剥开，纤维化程度低，白中带绿，水分充足，因此，有利于芽接成活。反之，IV组芽条和砧木于胁迫型环境条件下生长，形成层较薄，不易剥开，纤维化程度高，缺乏水分，因而不利于芽接成活。

由表1可知，不同地域的白木香种子苗作为砧木，对芽接成活率无显著性差异。虽然来自广东化州的砧木和来自海南的砧木在SNP基因分型中（图1）被聚类在不相同的分支，为不同地域白木香种群，但遗传差异没有显著影响芽接成活率。

表1 不同方法培养的芽条和砧木对芽片嫁接成活率的影响

2.3 砧木锯顶后不同生长条件对嫁接成活芽片抽芽率的影响

由表2可知，不同处理间芽片发芽率存在较大差异。A组被锯顶的植株得到充分光照，同时不被伤根，平均出芽率最高，为80.00%；B组由于被大量的其他未锯顶植株遮阴，被锯顶的植株光照严重不足，出芽率仅10.25%，C组通过移植方式保证被锯顶的植株得到充分光照，获得较高的出芽率，为69.17%，但移植伤根在一定程度上降低芽片发芽率。因此，提高芽片发芽率可在砧木预培养时扩大间距，一次性全部嫁接芽片。由于芽片嫁接成活率较高，可全部一次锯顶。同时可将少部分未嫁接成活植株移植其它苗床，保证被锯顶的植株得到充分的光照，提高芽片发芽率。

表2 砧木锯顶后不同生长条件对嫁接成活芽片的抽芽率的影响

3 讨论

白木香良种‘热科2号’在形态上和普通白木香无明显差异，但白木香SNP分型结果能区分‘热科2号’和来自海南和广东的白木香种群。‘热科2号’所产沉香的化学成份特征突出，品质优良，说明‘热科2号’是一个独特的优良品种，有必要扩大嫁接无性系生产。此外，SNP分型结果证实了‘热科2号’第一代嫁接苗和母树之间的关系，为选择第一代嫁接苗作为‘热科2号’嫁接苗生产的芽条植株提供了分子依据。

提高嫁接成活率直接影响生产的效率和成本。影响嫁接成活率的因素主要包括［10，27-28］：（1） 嫁接方法；（2）不同品系的砧木；（3）气候因子（温度、湿度等）；（4）砧木和芽条生长状况。通过试验发现不同白木香品系的砧木对嫁接成活率无显著影响，但砧木和芽条生长状况却有显著影响。

嫁接芽片需经历几个阶段才能够成活：（1）前期，芽片在薄膜密封的环境中，避免失水；（2）芽片和砧木之间逐渐形成维管束桥［29］；（3）芽片和砧木之间形成愈伤组织［30-32］；（4）嫁接口愈伤组织逐渐木质化，形成维管束［31-33］；（5）芽片上腋芽萌发。芽片和砧木之间形成维管束桥之前，由于缺乏物质交换的通道，芽片无法从砧木汲取养分，此时芽片形成愈伤组织所要求的养分全部由自身提供［34］，因此，芽片原有营养积累对嫁接成活有着重要作用。此外，有助于芽片和砧木间形成愈伤组织的其它因子（如植物激素）也影响嫁接成活率。

有研究表明，干旱胁迫对苹果砧木叶片叶绿体超微结构和抗氧化系统有显著影响，抑制通过光合作用合成碳水化合物［35］。碳水化合物是愈伤组织形成的能量基础［36］。在优化条件下生长的白木香植株光合效率较高，积累的碳水化合物等养分较为丰富。相反，在干旱等胁迫条件下生长的白木香植株光合效率降低，积累的碳水化合物等养分较为贫乏。这可能是导致不同条件下培养的白木香芽条和砧木嫁接成活率有显著差异的原因之一。

外源生长素（auxin，IAA）能提高嫁接口处维管束桥形成的速率及数目，促进愈伤组织的形成［37-39］。IAA能够促进黄瓜/番茄嫁接嫁接口形成层的活动，从而产生大量愈伤组织，形成维管束桥，提高嫁接苗成活率［39］。说明芽条和砧木内源IAA也有利于提高嫁接成活率。植物激素主要包括脱落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellin，GA）和生长素（IAA）。在干旱胁迫下，植物激素响应一般是上调ABA相对含量，下调IAA相对含量，总体上IAA/ABA下降，而ABA/IAA上升［40－41］，不利于嫁接口愈伤组织的形成。这可能是干旱等胁迫条件生长的白木香芽条和砧木用于嫁接的成活率不高的另一原因。

金花茶顶芽从营养生长向生殖生长转换过程中，ABA/GAs、ZRs/GAs和ABA/IAA逐渐提高，而IAA/ABA下降［42］。其它植物枝条在从营养生长向生殖生长转换过程，IAA/ABA会发生类似变化，分配到生殖构件中的生物量逐渐增多［43-44］，从而消耗积累的养分。因此，开花结果的白木香枝条作为芽条，嫁接成活率会降低，白木香优良无性系枝条生长2 a后易转化为生殖状态，倾向于开花结果。因此，应采用1.0～1.5 a生的白木香枝条作为芽条进行嫁接。作为砧木的白木香种子苗可以是多年生的，但用于嫁接前，要作断根移植处理，再复壮4个月，从而使其处于良好的非生殖生长状态。

优化砧木和芽条生长状况，芽片的嫁接成活率可达90%以上，但嫁接成活芽片的发芽率却有较大变化。嫁接后芽片上的芽在一定程度上处于休眠的状态，砧木锯顶后虽解除了顶端生长优势对其萌发的抑制，但其萌发还受多种因素影响。因此，取芽片过程中需避免芽点被破坏。研究表明，充足的光照通过改变内源激素GA、IAA和ABA的含量及比例［45-46］，启动芽的萌发［47-48］。同时，充分光照可提高温度，加强芽萌发后的光合作用，促进生长。因此，砧木锯顶后在充足的光照条件下生长，有利于芽片的抽芽。

在试验过程中发现，砧木锯顶后死亡是造成成活率降低的另一重要原因。影响砧木锯顶后死亡的主要因子是锯顶高度、环境温度和水分。较低锯顶的高度（离嫁接口25cm），可有效解除顶端生长优势，加快芽片的抽芽，但容易使锯顶砧木死亡；相反，锯顶的高度越高，这种致死的效果越小，但芽片发芽需要更长的时间。为此，可采用“二次锯顶”方法。第一次先在苗高的35%～40%位置锯顶，并通过抹掉不定芽的方式诱导嫁接成活芽片抽芽，待其萌发芽生长稳定后再次锯顶。

锯顶后环境温度过高（35℃以上），水分供应不足，易使砧木快速失水死亡。海南夏季常出现极端性高温，因此，需避开高温季节，使用合适透光率的遮阳网遮荫，同时保证充足水分，有利于提高成活率。

总之，优化各种培养条件可提高芽片的嫁接成活率和发芽率，有助于提高‘热科2号’嫁接苗的繁殖效率。