抗肿瘤多肽药物研究进展

李琬琼，高艳锋

（中山大学药学院（深圳），广东 深圳 518107）

恶性肿瘤严重威胁人类健康，其发病率和死亡率在近几年呈持续上升的趋势，我国的癌症防控形势依然严峻[1]。尽管近年来免疫治疗取得了突破性进展，手术、放疗和化疗仍然是临床上普遍采用的肿瘤治疗方法，寻找安全、合理、有效的肿瘤治疗方法是目前肿瘤治疗领域亟待解决的问题。多肽由几个到几十个天然或非天然氨基酸缩合而成，能够通过天然产物提取、基因重组和化学合成等方式获得。多肽药物具有免疫原性低、组织渗透性好、易于合成和改造、安全性好、不易在组织中蓄积等优点，在抗肿瘤、抗菌、慢性代谢性疾病、心血管疾病、免疫疾病等方面都表现出显著的疗效，目前有80余种多肽药物上市，150余种多肽药物正在开展临床试验。多肽药物的抗肿瘤机制具有多样性，它们可通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成、激活机体抗肿瘤免疫反应等机制抑制肿瘤的发生发展。由于多肽药物易于改造，人们通常将其进行修饰或融合以增加其肿瘤靶向性和口服给药的顺应性，延长体内作用时间；肿瘤归巢肽（tumor homing peptide，THP）、细胞穿膜肽（cell penetrating peptide，CPP）、自组装多肽、纳米颗粒等可作为优良载体参与抗肿瘤药物递送；此外，多肽药物还可作为分子探针监测体内肿瘤的转移。本文主要从抗肿瘤多肽药物的抗肿瘤作用机制、结构优化、靶向多肽和自组装，以及未来的发展趋势等方面展开综述。

1 多肽药物的抗肿瘤作用机制

1.1 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡又称程序性细胞凋亡，是一种细胞正常死亡的方式，在维持机体稳态方面发挥着重要作用。靶向肿瘤细胞的凋亡途径是癌症预防和治疗的有效策略，能够诱导肿瘤细胞凋亡的多肽是开发新型抗癌药物的重要候选者。景奕文等[2]发现乌贼墨多肽SHP可通过激活P53基因，调节Bcl-2等细胞凋亡相关基因的蛋白表达，从而抑制人前列腺癌细胞DU-145的增殖并诱导细胞凋亡。齐玲等[3]发现西兰花多肽组分Ⅱ可提高细胞Bax/Bcl-2蛋白比值，进而促进Caspase-3活化，诱导神经胶质瘤细胞凋亡。Valiyari等[4]发现人白细胞介素24（interleukin-24，IL-24）的最小重组体多肽sIL-24能够很好地抑制前列腺癌细胞（PC-3）、组织细胞淋巴瘤细胞（U937）和Burkitt's淋巴瘤细胞（Raji）等肿瘤细胞的增殖，对正常成纤维细胞（MRC-5）无影响，且sIL-24能够提高癌细胞中Bax/Bcl-2蛋白比值，促进细胞色素C释放增多且Caspase-3表达上调。靶向肿瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期相关的通路和靶点通常可以导致肿瘤细胞的凋亡，其难点在于大多数此类靶点位于细胞的内部，大多数多肽难以透过细胞膜而实现有效的靶向，往往需要穿膜肽等序列的辅助。

1.2 诱导肿瘤细胞坏死

细胞坏死是细胞由于受到物理或化学性的损害、缺氧与营养不良等因素而产生的一种被动死亡，坏死细胞会出现膜通透性增高、细胞器变形或膨大等现象。能够诱导肿瘤细胞坏死的多肽通常能够破坏肿瘤细胞膜，其比传统的化疗药物有着更高的选择性，且不会诱导多药耐药现象。研究发现，一种源自人类乳铁蛋白的PFR九肽（PFWRIRIRR-NH2）体外能够抑制白血病细胞MEL和HL-60的增殖、上调细胞内钙离子水平和诱导细胞膜的破坏，诱导肿瘤坏死现象的发生，体内实验结果也表明PFR肽有着较好的抗肿瘤效果和耐受性[5]。Wang等[6]发现，Polybia-MPI阳离子两亲性α-螺旋短肽能够选择性破坏癌细胞膜或形成跨膜孔导致各种白血病细胞坏死。靶向肿瘤细胞膜的优点是能克服耐药现象的发生，缺点是由于不同细胞的细胞膜之间存在相似性，仅仅依赖电荷或二级结构等特性难以得到高选择性靶向肿瘤细胞膜的多肽。

1.3 抑制肿瘤血管形成

实体瘤的生长必须依赖血管生成，新生的血管为肿瘤组织提供了营养和转移的通道，尽管目前对于血管生成抑制药物的作用机制（破坏血管或使血管正常化）尚存争议，但抑制肿瘤血管生成已被证明是一种有效的治疗手段。血管生成素2（angiopoietin 2，Ang2）/TEK受体酪氨酸激酶（TEK receptor tyrosine kinase，Tie2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）/血管内皮生长因子受体 2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）等信号通路均能够促进肿瘤血管生成，其中Ang2/Tie2可介导血管的不稳定性，VEGF/VEGFR2与内皮细胞增殖和血管形成密切相关[7]，单独阻断任意一条途径即可显著抑制肿瘤生长，同时干扰或阻断这2条途径引起的抑制效应亦可叠加[8]。Binétruy-Tournaire等[9]利用噬菌体展示肽库技术得到了能够特异性与人神经纤维网蛋白1（neuropilin 1，NRP1） 结 合， 阻 碍 VEGF165和VEGFR2相互作用的多肽AR7，体内外实验均显示AR7具有较好的抗血管生成及抑瘤活性。Tournaire等[10]以Tie2胞外区为靶标，利用噬菌体展示肽库技术得到能够特异性阻断Tie2信号的NS7肽，NS7肽能够显著抑制人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的迁移及鸡胚尿囊膜中血管的形成。Wu等[11]将上述AR7和NS7肽通过柔性连接子Ala-Ala连接起来，得到一种能够同时抑制Ang2/Tie2和VEGF/VEGFR2的新型多肽，该新型嵌合多肽在抑制肿瘤生长和血管生成方面比AR7和NS7单独使用及联合应用更有效。在后续的研究中，Zhu等[12]通过Fc片段修饰该嵌合多肽，能明显延长其半衰期，修饰后的多肽不仅可以阻断血管生成，而且可以抑制巨噬细胞的极化从而起到抗肿瘤作用。Choi等[13]开发并合成了一种具有肝素结合活性的多肽HBP，其能够抑制血管生成相关因子ERK、FAK和Akt的表达水平，同时削弱HUVEC分泌侵袭因子MMP2和MMP9的水平，体内实验中多肽HBP对乳腺癌移植瘤的生长也有显著的抑制作用，这些结果均表明多肽HBP可作为抗血管生成类抑瘤候选药物进行后续研发和临床推进。Jang等[14]从微生物土壤真菌青霉菌中分离得到2种环肽PF1171A和PF1171C，发现两者均能够显著抑制VEGF诱导的HUVEC的迁移、侵袭、增殖和管状形成以及鸡胚尿囊膜的新生血管形成，说明这2条环肽均可作为血管生成抑制剂进行后续研究。

1.4 激活抗肿瘤免疫应答

近年来，肿瘤免疫治疗以其卓越的疗效和创新性受到了广泛关注，2018年的诺贝尔生理学或医学奖授予了肿瘤免疫治疗领域的美国科学家James P. Allison和日本科学家Tasuku Honjo。T细胞尤其是CD8+T细胞是机体抗肿瘤免疫应答的核心，其激活需要双信号：第一信号为T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别抗原肽与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子的复合物；第二信号是T细胞表面相应受体与抗原提呈细胞上共刺激分子相结合。所以激活肿瘤特异性免疫应答，主要从增强以上2个信号着手。抗肿瘤多肽疫苗可加强T细胞激活的第一信号，它通过抗原提呈细胞识别肿瘤抗原并将其呈递给CD8+T细胞，进而引起相应细胞毒T淋巴细胞增殖并特异性杀伤肿瘤。抗肿瘤多肽疫苗研发的关键在于找到肿瘤特异性的抗原，肿瘤抗原包括过表达抗原、癌-睾抗原、癌胚抗原、分化抗原等肿瘤相关抗原和病毒抗原、突变抗原等肿瘤特异性抗原。这些抗原发挥抗肿瘤免疫功能的成分是8～17个氨基酸左右的抗原肽片段。

随着高通量测序技术的发展，基于肿瘤组织突变的肿瘤新抗原相关免疫疗法是一种真正个性化的疗法，因为大多数新抗原来源于每个肿瘤基因组中的独特突变[15]。Ott等[16]通过测序和分析患者肿瘤组织中的DNA和RNA序列，得到了含有20种肿瘤新抗原疫苗库，疫苗诱导的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞能够引起患者的特异性免疫应答，并成功应用于黑色素瘤病人的治疗。Quandt等[17]设计了同时包含TP53和Kras驱动基因突变的一组含有28～35个氨基酸的长肽LPs，各突变肽在携带相应突变的肿瘤患者中诱导T细胞的响应率高于野生型多肽，利用含有对应突变的长肽LPs免疫HLA（-A2/DR1）人源化小鼠，产生了针对大多数肽的CD8+/CD4+T细胞的免疫应答。目前国内外有大量的临床试验集中在该领域。

T细胞激活的第二信号是协同刺激信号，这些信号分子根据其功能分为共刺激和共抑制分子，共抑制分子又被称为免疫检查点分子，肿瘤微环境中免疫细胞表达的抑制性分子如程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4）、T细胞免疫球蛋白及免疫酪氨酸样抑制基序（T-cell immuno-globulin and ITIM domains,TIGIT）、 淋 巴 细 胞 活 化 基 因-3（lymphocyte activation gene-3, LAG-3）、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3（T cell immuno-globulin and mucin domain-3, TIM-3）等[18]，通过与T细胞或抗原提呈细胞表面配体互相作用使T细胞发生功能耗竭而不能发挥抗肿瘤作用，造成免疫逃逸现象的发生。阻断抑制性分子PD-1、CTLA-4、TIGIT、LAG-3、TIM-3等能够重新激活肿瘤微环境中的肿瘤特异性T淋巴细胞，打破机体已经建立起来的肿瘤免疫耐受机制，为肿瘤治疗带来希望。目前经美国FDA批准的针对免疫检查点分子的阻断剂主要是抗体类药物，但抗体生产成本高且半衰期长，一旦出现免疫不良事件不能及时撤药，所以多肽类免疫检查点抑制剂药物的研发十分必要。Chang等[19]以全化学合成的D构型PD-L1 IgV为靶标，通过噬菌体镜像展示肽库得到了能够在体外细胞水平阻断PD-1/PD-L1结合、体内具有抑瘤效果的抗酶解多肽DPPA-1，为肿瘤免疫治疗提供了小分子多肽候选物。Magiera-Mularz等[20]报道的大环肽抑制剂能够通过直接结合PD-L1来阻断PD-1/PD-L1通路，同时恢复T细胞的功能。Li等[21]通过细菌表面展示肽库得到了能够特异性结合PD-L1的多肽TPP-1，T细胞活化实验和混合淋巴细胞实验均证实TPP-1能够干扰PD-1/PD-L1相互作用，体内抗肿瘤实验证明TPP-1能够在H460移植瘤模型中减缓肿瘤生长。多肽已成为免疫检查点阻断药物的重要候选，但目前该方面的研究还有待加强。

综上，多肽药物可以作用于肿瘤细胞自身的靶点，通过凋亡和坏死等机制杀伤肿瘤细胞，还可以作用于肿瘤组织微环境中的新生血管和免疫细胞，起到抗肿瘤作用。除了上述作用机制以外，理论上来说，多肽药物可以像激素、小分子化学药物和单抗一样，作为激活剂或阻断剂作用于其他抗肿瘤的靶点，也可以作为疫苗的重要组分激发抗肿瘤免疫反应。

2 抗肿瘤多肽药物的优化

虽然多肽药物具有良好的疗效、安全性和耐受性，但批准上市的抗肿瘤多肽药物的适应证比较有限。限制多肽药物后续开发利用的主要原因是其易被蛋白酶水解、体内半衰期短、理化稳定性较差，这些缺点都导致其不能在体内稳定地发挥药效。此外，目前多肽类药物主要的给药途径为静脉注射、肌肉注射、皮下注射等方式，相较于这些给药方式，口服给药一直是多肽药物研究者努力的目标，但多肽的口服给药生物利用度低，寻找合理有效的口服递送策略也是多肽药物发展面临的难题。因此，对多肽药物进行有效的优化非常必要。

2.1 延长半衰期

延长多肽药物体内循环半衰期的主要策略有2种：增强多肽抗酶解能力进而提高其体内稳定性；增加其流体力学半径从而减少肾小球的滤过作用。提高多肽酶降解稳定性的策略是对其氨基酸序列进行改造，如乙酰化修饰、引入D构型氨基酸两端保护、逆序翻转L肽为D肽、环化修饰或改善结构为具有α-螺旋形状的钉合肽[22]等。增加多肽流体力学半径的常见方法为增加多肽的相对分子质量，可通过基因工程方法将多肽与免疫球蛋白Fc片段或白蛋白融合，或通过化学法将多肽与高分子化合物聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）、PAS（含有Pro、Ala和Ser的多聚肽链重复序列）等共价连接；此外，由于人血浆白蛋白在血浆中含量丰富、相对分子质量大、体内循环半衰期长，可作为体内运输多肽药物的可靠载体，因此也可将多肽药物偶联白蛋白亲和肽或脂肪酸修饰以达到延长半衰期的目的[23-24]。

2.2 改变剂型

80%左右的蛋白多肽类药物经注射途径给药，虽然注射给药体内分布迅速、吸收较快，但生物利用度和患者依从性都较差。注射剂药物传递系统（drug delivery system, DDS）能够通过改变制剂的方法将药物在一定时间内递送到特定组织部位，同时提高了药物的靶向性、减少了多肽注射给药产生的毒副作用[25-26]。用于前列腺癌及乳腺癌治疗的Zoladex（活性成分为醋酸戈舍瑞林）植入剂可直接注射于患者皮下或肌肉内，且该植入剂能够自行在体内降解，无需通过手术取出，减少了药物不良反应。能够控制缓释和靶向的植入剂和注射剂（微球、脂质体、纳米颗粒）等均具有良好的应用前景。

抗肿瘤多肽类药物活性容易受到温度和酸碱度等因素影响，多肽口服给药顺利进行需克服胃肠道消化酶的酶解作用和肠道细胞对水溶性物质的低通透性两大壁垒。因此在多肽口服药物的研发中，研究人员通常使用蛋白酶抑制剂和促吸收剂来增加多肽药物的口服生物利用度。甘胆酸钠、甲磺酸卡莫司他、杆菌肽、抑肽酶等能够抑制胃肠道中消化酶的活性；促吸收剂主要包括水杨酸类、胆酸盐类、表面活性剂、脂肪酸类、氨基酸类衍生物和金属螯合剂等[27]。此外，将多肽药物包裹在高分子纳米微球中不但可防止胃肠道的酸性环境和消化酶对药物的降解作用，还可以达到长效释药或靶向治疗的目的[28]。

3 靶向多肽和自组装

3.1 肿瘤归巢肽和靶向肽

THP主要是一些靶向肿瘤或肿瘤微环境（如肿瘤内皮、淋巴管或肿瘤细胞等）的包含3～10个氨基酸的小肽，由于它们的肿瘤靶向性和高渗透性，通常可作为肿瘤相关诊断试剂或作为靶向分子引导抗肿瘤药物进入肿瘤部位发挥抗肿瘤效果，这在很大程度上减少了药物的毒副作用、增加了药物在肿瘤部位的分布。THP可以修饰在包裹药物的纳米颗粒表面，将药物靶向递送至肿瘤组织[29-30]。将多肽药物融合整合素亲和肽RGD也可达到提高多肽药物肿瘤靶向性的目的[31-33]，或利用肿瘤微环境偏酸性的特点，以酸响应纳米载体包裹抗肿瘤多肽[34]或直接设计肿瘤pH响应的多肽药物以期达到缓释和提高多肽在肿瘤部位的利用率。此外，由于肿瘤组织高表达基质金属蛋白酶MMP2等，利用此特性，可设计该酶特异识别的连接子序列，使多肽前药到达肿瘤组织后被MMP2水解，释放出活性片段[35-36]。

3.2 穿膜肽

大多数CPP是一类富含精氨酸和赖氨酸（大多数带有正电荷、pH接近中性）的小分子多肽，人们通常将其与纳米颗粒、蛋白、核酸等需进入胞内发挥活性的抗肿瘤药物以共价或非共价形式连接，通过细胞内吞作用或跨膜转导等方式到达胞内发挥作用。对于肿瘤胞内靶标的药物来说，设计合理的渗透策略对药物的递送是十分必要的，穿膜肽作为优良的药物递送载体在该领域引起了广泛关注。Gronewold等[37]发现一种具有高内化能力、能选择性杀死某些肿瘤细胞类型的分支穿膜肽，该多肽对癌细胞的细胞毒活性显著高于正常成纤维细胞，在MCF-7癌细胞系中可以高效递送抗癌药物放线菌素D，显示出较高的后续研究和转化价值。Gao等[38]发现一种具有MCF-7癌细胞高渗透性的电中性环肽环孢菌素A（CsA），将CsA与促凋亡肽（PAD）缀合后，CsA-PAD表现出更高的癌细胞毒性，其作用效果类似于阳离子穿透肽TAT，但全身细胞毒性特别是心脏和肝毒性远远低于TAT-PAD，这些都说明穿膜环肽CsA具有重要的应用价值。穿膜肽可以通过受体介导的内吞、膜融合、“地毯”模式、反转微团模式和打孔模式等不同机制进入细胞[39]，使得多肽能够像小分子药物那样作用于细胞内的靶点发挥功能。

3.3 自组装多肽

自组装多肽是能够利用疏水作用、氢键、范德华力等非共价键自组装成为囊泡、纳米纤维、纳米粒、纳米管等高度有序的纳米结构的一类多肽，这些自组装肽可作为药物载体用于改善药物特性、起到缓释和靶向的作用，基于肽纳米材料的药物递送系统具有良好的生物相容性和较低的毒副作用，受到研究者们的青睐。在最近的研究中，Liu等[40]合成了一种含有48个氨基酸的能够自组装且具有抗肿瘤活性的多肽RADA-KLA，该活性肽包含能够诱导癌细胞死亡的肽段KLA和2003年Zhang[41]开发的具有交替正负电荷氨基酸残基的两亲性肽RADA-16肽，RADA-KLA克服了KLA多肽免疫原性强、细胞穿透性差、体内快速降解的缺点，体外实验表明RADA-KLA纳米纤维可抑制肝癌细胞的黏附和迁移并诱导肝癌细胞死亡。Chen等[42]通过合理设计具有程序性自组装功能的分枝状两亲嵌合肽CRRK负载阿霉素，能够达到控制药物释放、防止药物过早释放、准确将药物递送到肿瘤细胞核的目的，该设计通过巧妙的序列排列成功实现了针对多药耐药肿瘤细胞的刺激响应性药物释放。

4 多肽与分子成像

除了作为药物用途以外，多肽还可以作为分子探针工具用于肿瘤的分子诊断和成像。分子成像技术能够远程、非侵入性地感知和检测活体中的细胞和分子过程，随着信号转导级联和蛋白质相互作用网络的研究深入，人们也发现了越来越多的癌症治疗和成像的相关靶标。以多肽为基础的成像探针有着体内循环半衰期短及实体肿瘤内高渗透的优点，能够很好地渗透到靶组织中，快速地结合肿瘤或其他病变区域。de Oliveira等[43]利用锝-99m放射性标记能够特异性结合胃癌、结直肠癌和胶质瘤肿瘤血管的多肽GX1，体内研究表明大多数器官和组织在60 min内能较好地清除该放射性多肽，该放射性标记的GX1肽有望成为不同类型肿瘤成像的生物标志物，为肿瘤的早期检测提供了新的工具和方法。Chatterjee等[44]通过铜-64标记PD-L1亲和肽WL12，PET成像结果显示[64Cu] WL12可作为放射性示踪剂特异性检测表达PD-L1的肿瘤，为肿瘤免疫治疗策略的制定提供了依据。

5 结语与展望

多肽药物与小分子化学药物相比具有选择性和特异性好、毒副作用低的优点，与单抗药物相比具有成本低、组织渗透性好、易于改造等优点，因此在肿瘤治疗药物的研究中受到广泛关注。尤其是近年来取得重要进展的肿瘤免疫疗法，也离不开多肽药物，多肽不但可以作为肿瘤抗原激活抗肿瘤免疫，而且也可以阻断免疫检查点分子。但目前上市的抗肿瘤多肽药物主要以激素类似物为主，而作为靶点阻断性药物还比较少，主要原因是受限于多肽药物的半衰期短，难以达到足够高的有效浓度；而构象的柔性和多变又使得其难以达到单抗药物的高亲和力。未来多肽药物的发展将继续在现有多肽先导物的基础上，结合生物信息学和高通量组合化学等方法进行合理有效的设计和筛选，改善其在体内存留时间、靶向性、物理化学性质等方面存在的不足。目前多肽药物主要通过注射（静脉、肌肉、皮下注射）或非注射（皮肤、口腔、鼻腔等）给药的方式到达其作用组织或靶标，患者更倾向于口服给药，但多肽口服生物利用度低，合理的修饰、转变剂型和给药方式、减少给药频次仍将是多肽药物今后努力的方向。近年来，合理的结合多肽药物、小分子化学药物和单抗药物的优点，设计肽体和多肽-小分子药物偶联物为多肽药物的研发开辟了新的方向[45-46]。而肿瘤免疫疗法的重新兴起，使得合理利用肿瘤患者的个体化差异，发掘肿瘤组织和微环境中潜在的靶点和突变表位成为肿瘤的个体化治疗和抗肿瘤多肽药物开发的重点方向。