DHA玻璃体注射对ARMD大鼠模型光感受器细胞凋亡和PI3K/Akt通路的影响

王 辉，沈 玲，姬 翔

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)多发生于50岁以上老年人，又被称为老年黄斑变性。随着社会老龄化的加剧，ARMD发病率逐年上升，已成为第三大致盲原因，严重威胁中老年人身体健康[1]。ARMD分为干性和湿性两种类型，临床中以干性患者为主。目前，干性ARMD主要应用抗氧化剂进行治疗，缺少有效的药物缓解ARMD进展[2]。磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/serine threonine protein kinase，PI3K/Akt)信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，可调控下游多种活化因子，参与细胞的增殖、分化和凋亡等生命过程[3]。研究表明，PI3K/Akt信号通路在增殖性玻璃体视网膜病、后发性白内障、青光眼等多种眼科疾病的发生和发展过程中发挥关键作用[4]。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是人体必须的不饱和脂肪酸，可促进视网膜光感受器细胞和中枢神经系统的发育。研究表明，DHA可能通过ROS/Nrf2途径诱导视网膜色素上皮细胞表达HO-1，从而发挥对视网膜色素上皮细胞的保护作用[5]。饮食补充DHA可能通过提高胰岛素敏感性，降低血清成纤维细胞生长因子21显著改善非酒精性脂肪性肝病患者血脂水平[6]。DHA可降低人视网膜色素上皮细胞ARPE-19凋亡率，诱导ARPE-19细胞HO-1 mRNA和蛋白表达，对ARPE-19细胞发挥保护作用[7]。目前，DHA对ARMD患者光感受器影响的研究相对较少。本研究通过光损伤法建立ARMD大鼠模型，研究DHA对ARMD大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响，并探讨了其可能的作用机制，以期为该疾病的治疗提供新方法。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康雄性SD大鼠60只，清洁级，8周龄，体质量160～230g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号：SCXK(沪)2017-0005。大鼠自由饮水和饮食，饲养温度20℃～25℃，湿度50%～56%，光照12h。本研究经本院动物伦理委员会批准同意。

1.1.2实验试剂和仪器DHA(批号：20171115)，美国Sigma公司；TUNEL试剂盒(批号：20171216)，瑞士罗氏(Roche)公司；TNF-α(批号：20171216)和IL-6(批号：20171329)试剂盒，南京建成生物工程研究所；BCA试剂盒(批号：20180125)，上海碧云天公司；NF-κBp65(批号：Bs-0467R)和p-NF-κBp65(批号：Bs-0458R)抗体，北京博奥森生物技术有限公司；PI3K(批号：Sc1236)和p-PI3K抗体(批号：Sc1152)，Santa Cruz公司；Akt(批号：9275)和p-Akt(批号：9246)抗体，美国Cell Signaling公司；Bax(批号：Sc1215)和Bcl-2(批号：Sc1237)抗体，美国Santa Cruz公司；cleved-caspase-3抗体(批号：20180214)，武汉博士德生物工程有限公司。珊顿石蜡切片机，英国；XSP-9CA光学显微镜，上海光学仪器一厂；H-600型透射电镜，日本日立公司。

1.2方法

1.2.1实验分组和模型建立大鼠适应性饲养7d后，按照随机数字表法分为空白对照组、模型组、低剂量DHA组(L-DHA组)、中剂量DHA组(M-DHA组)和高剂量DHA组(H-DHA组)，每组12只。参照文献方法采用视网膜光损伤法建立干性ARMD大鼠模型[8]。L-DHA组、M-DHA组和H-DHA组分别按剂量2.5、5.0、10μg/kg玻璃体注射DHA[9]。空白对照组和模型组注射等量生理盐水。造模起开始治疗，每10d注射一次，注射5次。

1.2.2标本采集最后一次给药结束后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，断颈处死，冰浴下摘取眼球，沿赤道部剖开，剥离视网膜组织。其中每组中6只大鼠右眼视网膜组织4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片，HE染色后行病理学观察和TUNEL检测。6只大鼠的左眼视网膜组织2.5%戊二醛固定，行透射电镜观察。剩余6只大鼠视网膜组织-80℃保存备用。

1.2.3 TUNEL原位凋亡检测石蜡切片经常规脱蜡处理、PBS冲洗后，将切片置于湿盒中，滴加50μL蛋白酶工作液，37℃水浴20min，PBS冲洗3次，滴加20μL TUNEL反应液，37℃水浴1h。PBS冲洗3次后，滴加20μL Converter-POD溶液，37℃水浴30min。PBS冲洗3次后，滴加50μL DAB工作液进行显色反应，PBS冲洗。苏木素复染10s，自来水漂洗，盐酸、酒精分化数秒，自来水漂洗，1%氨水泛蓝，自来水漂洗。酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。400倍镜下观察TUNEL染色切片，分别计算外核层和神经节细胞层细胞凋亡指数(AI)。AI =凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4酶联免疫吸附法测定视网膜组织TNF-α和IL-6水平取视网膜组织1g，添加9mL生理盐水于匀浆器中制备组织匀浆液，3000r/min离心10min后，保留上清，参照酶联免疫测定视网膜组织TNF-α和IL-6水平，在酶标包被板添加50μL标准品，设空白孔(不添加样品和酶标试剂)、待测样品孔，将40μL样品、10μL亲和素加入待测样品孔，封板后37℃反应30min，清洗、拍干后，添加50μL酶标试剂(空白孔除外)，封板后37℃温育30min，洗涤、拍干后，添加100μL显色剂，37℃避光放置5min，添加50μL终止液结束反应，于450nm波长检测各孔OD值，绘制标准品曲线计算样品浓度。

1.2.5 Western Blot检测蛋白表达取视网膜组织，充分裂解后，BCA法定量蛋白含量。取30μg蛋白质，加入上样缓冲液，95℃煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将蛋白条带转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶37℃封闭1h。TBST洗膜后，分别加入Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3、p-PI3K、p-Akt和Bcl-2一抗(1∶300)，4℃孵育12h。TBST洗膜，加入HRP标记IgG二抗(1∶5000)，37℃孵育2h。TBST洗膜，加入ECL发光液，避光显影，凝胶成像系统自动显影，扫描Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3、p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，各蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2结果

2.1各组大鼠HE染色结果各组大鼠视网膜总厚度、外核层和内核层厚度比较，差异有统计学意义(F=175.879、12.668、19.387)。与空白对照组比较，模型组大鼠视网膜总厚度、外核层和内核层厚度均降低，差异有统计学意义(t=23.004、5.934、7.182，P<0.05)。与模型组比较，M-DHA组和H-DHA组大鼠视网膜总厚度、外核层和内核层厚度均升高，差异有统计学意义(tM-DHA组=13.427、3.099、4.349，tH-DHA组=19.733、5.050、5.985，P<0.05)；L-DHA组大鼠视网膜总厚度升高，差异有统计学意义(t=7.381，P<0.05)，外核层和内核层厚度升高，但差异无统计学意义(P>0.05，图1，表1)。

图1各组大鼠HE染色结果(×400)A：空白对照组；B：模型组；C：L-DHA组；D：M-DHA组；E：H-DHA组。

图2各组大鼠TUNEL染色结果(×400)A：空白对照组；B：模型组(黑色箭头所示为TUNEL阳性细胞)；C：L-DHA组；D：M-DHA组；E：H-DHA组。

图3各组大鼠视网膜神经节细胞超微结构(×5000)A：空白对照组；B：模型组；C：L-DHA组；D：M-DHA组；E：H-DHA组。N：神经节细胞的细胞核；M：神经节细胞的线粒体；V：空泡。

组别视网膜总厚度外核层内核层空白对照组167.25±5.2122.37±2.6143.16±3.15模型组110.23±3.14a15.37±1.24a31.24±2.57aL-DHA组124.35±3.57c16.43±1.2833.11±2.59M-DHA组139.43±4.35c18.62±2.25c37.82±2.67cH-DHA组158.34±5.11c21.05±2.46c40.61±2.87c

注：aP<0.05vs空白对照组；cP<0.05vs模型组。

2.2各组大鼠视网膜细胞凋亡情况如图2所示，TUNEL阳性细胞(黑色箭头)主要分布在神经节细胞层和视网膜外核层中。各组大鼠神经节细胞层和外核层细胞凋亡指数比较，差异有统计学意义(F=125.379、150.245，P<0.001)。与空白对照组比较，模型组大鼠神经节细胞层和外核层细胞凋亡指数升高，差异有统计学意义(t=20.579、19.833，P<0.05)。与模型组比较，M-DHA组和H-DHA组大鼠神经节细胞层和外核层细胞凋亡指数降低，差异有统计学意义(tM-DHA组=7.934、7.518，tH-DHA组=14.656、14.585，P<0.05)；L-DHA组降低，但差异无统计学意义(P>0.05，图2，表2)。

组别神经节细胞层外核层空白对照组8.37±1.216.13±0.82模型组77.51±8.14a62.15±6.87aL-DHA组68.35±8.2356.43±6.12M-DHA组42.18±7.26c36.62±4.69cH-DHA组22.54±4.26c17.15±3.15c

注：aP<0.05vs空白对照组；cP<0.05vs模型组。

2.3各组大鼠透射电镜观察超微结构视网膜神经节细胞超微结构见图3。空白对照组视网膜神经节细胞具有均匀正常出现的细胞核和线粒体。模型组出现空泡化，染色质边缘化，染色质浓缩，线粒体肿胀和嵴缺失。DHA治疗后，空泡化、染色质边缘化、染色质浓缩以及线粒体肿胀的不同程度改善。H-DHA组线粒体和细胞核基本正常，与空白对照组较为相似。

2.4各组大鼠视网膜组织TNF-α和IL-6水平比较各组大鼠视网膜组织TNF-α和IL-6表达水平比较，差异有统计学意义(F=18.729、80.136，P<0.001)。与空白对照组比较，模型组大鼠视网膜组织TNF-α和IL-6表达水平均升高，差异有统计学意义(t=6.846、13.079，P<0.05)。与模型组比较，M-DHA组和H-DHA组大鼠视网膜组织TNF-α和IL-6表达水平均降低，差异有统计学意义(tM-DHA组=4.132、6.828，tH-DHA组=5.824、11.965，P<0.05)；L-DHA组降低，但差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

图4各组大鼠视网膜组织相关蛋白条带A：空白对照组；B：模型组；C：L-DHA组；D：M-DHA组；E：H-DHA组。

组别TNF-αIL-6空白对照组1.21±0.343.42±0.28模型组2.97±0.53a7.15±0.64aL-DHA组2.58±0.476.73±0.53M-DHA组1.87±0.38c4.92±0.48cH-DHA组1.46±0.35c3.61±0.34c

注：aP<0.05vs空白对照组；cP<0.05vs模型组。

组别p-PI3K/PI3Kp-Akt/AktBaxBcl-2p-NF-κBp65/NF-κBp65cleved-caspase-3空白对照组0.59±0.030.55±0.030.07±0.010.49±0.030.13±0.010.11±0.01模型组0.13±0.01a0.07±0.01a0.59±0.03a0.22±0.02a0.38±0.02a0.19±0.01aL-DHA组0.22±0.020.11±0.010.56±0.020.23±0.010.34±0.020.18±0.02M-DHA组0.39±0.02c0.26±0.02c0.32±0.02c0.29±0.02c0.26±0.03c0.16±0.03cH-DHA组0.48±0.03c0.39±0.02c0.12±0.01c0.35±0.030.15±0.02c0.13±0.02c

注：aP<0.05vs空白对照组；cP<0.05vs模型组。

2.5各组大鼠视网膜组织相关蛋白表达各组大鼠视网膜组织Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3、p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白比较，差异有统计学意义(F=916.895、168.682、17.842、390.788、624.947、76.125，P<0.01)。与空白对照组比较，模型组大鼠视网膜组织Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白表达升高，差异有统计学意义(t=40.279、27.386、 13.856，P<0.05)；p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达降低，差异有统计学意义(t=35.631、37.181、18.343，P<0.05)。与模型组比较，M-DHA组和H-DHA组大鼠视网膜组织Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白表达降低，差异有统计学意义(tM-DHA组=18.343、8.152、2.324，tH-DHA组=36.406、19.919、6.573，P<0.05)；p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达升高，差异有统计学意义(tM-DHA组=28.482、20.813、3.184，tH-DHA组=27.111、35.054、8.832，P<0.05，图4，表4)。

3讨论

ARMD是一种眼科常见的视网膜黄斑退行性病变，由年龄、饮食、环境等多种因素引起的综合病症，对患者视力造成严重损伤[10]。目前，ARMD的发病机制尚不十分明确，但其病理已经证实与患者视网膜光感受器细胞的凋亡有密切关系。因此，开发新的能够抑制光感受器细胞凋亡的药物，延缓病情，减轻患者痛苦具有十分重要的意义。

DHA是人体必须的高度不饱和脂肪酸，不能由自身合成，主要从食物中获取。DHA作用广泛，具有抗神经炎症、抗氧化等功能，对帕金森、老年痴呆、黄斑变性等疾病有一定的预防作用。有报道称，与不含DHA藻油的大豆调和油饲养的大鼠相比，含DHA藻油的大豆调和油饲喂的SD大鼠视网膜组织细胞层次更为清楚，细胞生长正常并且排列紧密，杆状细胞、锥状细胞清晰可见，说明DHA有益于视网膜组织细胞的生长发育[11]。艾明等[12]研究表明，DHA可抑制N-甲基-N-亚硝脲(MNU)对视网膜光感受器细胞超微结构的损伤，具有较好的保护作用，是一种潜在延缓视网膜色素变性病程进展的有效药物。本研究结果显示，模型组大鼠视网膜总厚度、外核层和内核层厚度较空白对照组降低，视网膜神经节细胞层和外核层细胞凋亡指数升高，神经节细胞出现空泡化，染色质边缘化，染色质浓缩，线粒体肿胀和嵴缺失现象，提示模型组大鼠视网膜光感受异常，细胞凋亡。经DHA治疗后，可明显改善视网膜神经节细胞染色质边缘化和浓缩、线粒体肿胀等现象，增加视网膜总厚度、外核层和内核层厚度，以及降低视网膜神经节细胞层和外核层细胞凋亡指数，随着给药剂量的增加，视网膜神经节细胞逐渐得到恢复，具有剂量依赖性，与相关研究报道结果一致，提示DHA可保护ARMD大鼠光感受器细胞凋亡，可能是潜在治疗ARMD疾病的药物。

为了了解DHA保护ARMD大鼠光感受器细胞凋亡的作用机制，本研究基于PI3K/Akt信号通路进行了简单探讨。本研究结果显示，与空白对照组比，模型组大鼠视网膜组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平降低，PI3K是一种可使肌醇环第3位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，Akt是PI3K的下游作用靶点。PI3K被激活后生成的磷脂产物进一步激活Akt及其下游信号级联反应，参与细胞的生长和发育、抗凋亡等过程。近年来研究发现，PI3K/Akt信号通路与眼部疾病关系密切[13]， 陈春丽等[14]发现上调ARMD视网膜色素上皮细胞PI3K/Akt信号通路，可降低细胞氧化应激损伤，发挥细胞保护作用。结合文献本研究结果提示PI3K/Akt信号通路可能参与ARMD的发生。本研究发现玻璃体注射DHA后，p-PI3K和p-Akt蛋白水平升高，随着注射剂量的升高，p-PI3K和p-Akt蛋白水平逐渐升高。玻璃体内注射DHA可减轻NaIO3诱导的ARMD大鼠模型的感光细胞损伤[7]。DHA抑制PI3K活性，进而降低非小细胞肺癌(NSCLC)细胞活力，诱导细胞凋亡[15]。基于此，本研究推测DHA可能通过激活PI3K/Akt信号通路，促进p-PI3K和p-Akt蛋白表达，DHA可能也通过PI3K/Akt信号通路缓解视网膜组织损伤，进而发挥对ARMD的保护作用。本研究结果显示，模型组大鼠视网膜组织Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白、炎性因子TNF-α和IL-6表达升高，p-PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达降低；研究表明PI3K/Akt信号通路可促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，抑制细胞凋亡[16]；Dilly等[17]研究发现，激活PI3K/Akt信号通路能够活化NF-κB上调TNF-α、IL-6等炎性因子的表达；仇志富等[18]研究发现，PI3K/Akt信号通路可抑制caspase-9磷酸化，降低caspase-3表达，降低细胞凋亡。以往研究证实，激活PI3K/Akt信号通路，可增强Bcl-2表达，下调Bax表达，促进慢性高眼压SD大鼠初级视皮质神经元损伤的修复，改善神经元细胞超微结构以及降低眼压[19]。基于以上研究推测ARMD大鼠视网膜组织损伤后下调PI3K/Akt信号通路，进而激活caspase-3通路，造成ARMD大鼠光感受器细胞凋亡。本研究结果显示，经DHA干预后视网膜组织Bax、p-NF-κBp65和cleved-caspase-3蛋白表达及炎性因子TNF-α和IL-6表达均降低，具有剂量依赖性。研究发现DHA可能通过Nrf2途径诱导视网膜色素上皮细胞表达HO-1，降低视网膜色素上皮细胞凋亡，从而发挥对视网膜色素上皮细胞的保护作用[5]。推测DHA可能通过上调PI3K/Akt信号通路降低ARMD大鼠光感受器细胞凋亡，进而发挥对ARMD的保护作用。

综上所述，DHA可降低ARMD大鼠光感受器的细胞凋亡，其可能通过激活PI3K/Akt信号通路，上调p-PI3K和p-Akt蛋白表达，进而抑制下游凋亡相关蛋白表达，从而发挥抗凋亡作用的，是治疗ARMD的潜在药物。本研究也存在一些不足，ARMD机制较复杂，DHA是否通过其它途径发挥保护作用，还有待后续深入研究。