地方鸡ONECUT1基因的序列变异分析

朱丽莉， 李冬光， 綦世金， 陶宇航， 韩 雪， 伍革民*

(1.贵州省农业科学院 畜牧兽医研究所， 贵州 贵阳 550005； 2.铜仁职业技术学院， 贵州 铜仁 554300)

贵州省地方鸡遗传资源丰富，普遍具有耐粗饲、抗逆性强、适应性强、肉质鲜美细嫩等特性，是培育我国优质鸡的重要遗传材料，但受限于繁殖性能和品种综合性状水平不高而未被广泛应用于育种生产中。家禽繁殖活动是由多因素调控的复杂过程，主要受遗传、环境、营养等因素综合影响，其中在环境因子与繁殖性能互作关系研究中发现，光照是极为重要的影响因素之一。光照是驱动生物体生物节律的原始动力，其激发的中心节律维系了生物机体组织器官的正常活动[1]和调控家禽繁殖活动[2-4]。

ONECUT基因家族包括ONECUT1、ONECUT2和ONECUT3，是根据基因含有单独的CUT域和同源域的结构特征而命名[5-6]。ONECUT基因家族编码的蛋白质产物在神经发育、免疫系统调节、光色素基因表达调控等方面发挥重要作用。ONECUT1又名哺乳动物肝细胞核因子(Hepatocyte Nuclear Factor-6,HNF-6)，属于组织特异性转录因子，调节胚胎期消化器官肝脏、原肠、神经器官的生长发育，通过控制代谢基因转录参与调控糖代谢过程[6]。研究发现，秀丽隐杆线虫、果蝇、海胆、斑马鱼和小鼠的ONECUT1基因与神经发育有关[7-11]。JACQUEMIN等[12-13]研究表明，ONECUTl基因在哺乳动物肝脏、胆管和胰腺中均有表达，影响其胆汁的分泌，参与调节免疫系统。郭正阳等[14]发现，ONECUT与雌性特异性和二态性有关，可促进肝细胞增殖，参与肿瘤发生、组织再生等生理过程。WU等[15]研究表明，ONECUTl基因是小鼠视网膜发育的主要调控基因，可能与视网膜神经元水平细胞中起源和维持有关。GOETZ等[16]对小鼠视网膜神经元细胞发育的调控因子进行研究表明，在小鼠视网膜发育阶段ONECUT1基因表达量较高；在敲除了ONECUT1基因的个体中发现黑视蛋白(光敏感神经节细胞中光色素)和光色素基因的表达上调，说明ONECUT1基因可能与视网膜的感光作用相关。

目前，ONECUT1基因的研究主要集中在软体动物和部分哺乳动物中，关于该基因家族的DNA序列变异、基因表达与调控,以及该基因编码的蛋白质的生理功能等方面的研究在猪、牛、羊以及鸡中等均未见报道。因此，选用贵州省地方鸡种荔波瑶山鸡、长顺绿壳蛋鸡、赤水乌骨鸡、水西乌骨鸡、广西乌骨鸡为研究材料，分析ONECUT1基因在5个贵州地方鸡品种或群体间的序列差异性，为ONECUT1基因在贵州地方品种鸡中的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验鸡群

荔波瑶山鸡选自贵州省贵阳市乌当区百宜乡洛坝村种鸡场，长顺绿壳蛋鸡选自长顺县绿壳蛋鸡养殖场，赤水乌骨鸡、水西乌骨鸡、广西乌骨鸡均选自贵州省农业科学院畜牧兽医研究所动物试验场。样本选择要求群体健康、一致性较好、性能较为稳定。基本采用常规饲养管理方式，个体笼养。各品种或遗传群体随机选择30只鸡，翅下静脉采血1～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20℃保存，用于提取基因组DNA。

1.2 基因组 DNA提取及引物设计

采用TIANamp Blood DNA Kit试剂盒提取血样中的DNA。根据GenBank中鸡的ONECUTl基因序列(NM_205243.1)，合成4对引物检测ONECUT1基因在各品种或遗传群体个体中的基因型遗传变异情况。检测的位点、引物序列、扩增长度以及检测方法如表1。所有引物由天根生化科技有限公司合成。

表1 不同鸡基因型检测的引物序列

1.3 PCR扩增及测序

PCR反应体系20 μL:DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix试剂10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反应程序：95℃预变性6 min；95℃变性30 s，特定温度(各引物的退火温度见表1)退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物委托诺赛基因组研究中心有限公司纯化回收后进行双向测序。

1.4 数据处理

使用DNAstar对测序结果进行校正，进入基因库网站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN分析SNPs变异导致蛋白质编码变异情况。Excel统计试验鸡ONECUTl基因分型情况。

2 结果与分析

2.1 不同鸡品种的多态位点

由表2可见，4对引物仅有1对引物检测出4个多态位点，其余3对引物均未检测多态位点。与鸡的全基因组序列(gallus 5版)比对发现，4个多态位点均位于内含子上，分别是16 369位置C→A，16 517位置C→T，16 587位置C→G，16 639位置C→T。

表2 鸡品种检测出的 4个多态位点

2.2 多态位点品种间的差异

由表2可知，在ONECUTl基因16 369位置上，瑶山鸡、长顺绿壳蛋鸡、赤水乌骨鸡、水西乌骨鸡和广西乌骨鸡均在该序列位置为A，而NCBI登录序列该位置为碱基C；在16 517位置上，长顺绿壳蛋鸡与NCBI登录序列一致，该位置碱基为C，其他4个鸡品种在该序列位置均为碱基T；在16 587位置上，瑶山鸡和赤水乌骨鸡在该位置检测出多态性(C或G，图1)，其他3个品种鸡在该序列位置为碱基C，无序列变异；16 639位置上，瑶山鸡和赤水乌骨鸡在该位置检测出多态性(C或T)，其他3个品种鸡在该序列位置无变异，均为碱基C。

图1 不同鸡品种杂合子的波峰

3 结论与讨论

鸡ONECUT1基因定位于10号染色体上，全长12 072 bp，mRNA包括2个外显子和1个内含子，编码450个氨基酸。通过GenBank数据库检索，到目前为止，共检索到ONECUT1基因8 626个SNP，这些SNP主要分布于人中，在鸡中尚未有该基因SNP的登录信息，通过文献检索也未发现该基因在鸡中的序列变异报道。试验主要针对该基因的外显子区域设计引物，在5个地方鸡品种的序列变异检测出4个多态位点，均分布在第一内含子上，分别为16 369位、16 517位、16 587位和16 639位。从4个多态位点在5个地方鸡品种的分布看，长顺绿壳蛋鸡在16 517位置为碱基C，与GenBank参照序列一致，而瑶山鸡、赤水乌骨鸡、水西乌骨鸡和广西乌骨鸡在该位置为碱基T；瑶山鸡和赤水乌骨鸡在16 587位置和16 639位置检测出多态(C/G和C/T)，长顺绿壳蛋鸡、水西乌骨鸡和广西乌骨则与GenBank参照序列一致，为碱基C。研究表明，该基因序列变异具有品种特异性，与品种的进化选择有关。在许多疾病相关基因中位于deep内含子内的突变影响pre-mRNA的剪接过程[17]。最常见的剪接突变形式是通过产生或增强剪接位点或产生新的分支点而导致异常剪接。在特定的内含子中，突变可以创造新的剪接位点，成为新外显子的边界，从而使新产生的外显子被包含在成熟的mRNA产物中。但并不是所有位于内含子的突变均产生或增强剪接位点，提示有其他未知的剪接调控元件。试验4个突变点是否能改变剪接机制处理内含子的方式，进而参与到动物机体的生理调控机制中，又在其中发挥何种作用；4个位点在不同地方鸡品种间的差异性是否为其品种特异性，或与重要经济性状有关有待进一步的研究。ONECUT1基因在5个地方鸡品种在外显子区域无序列差异，说明该基因蛋白质编码区域序列保守。鸡ONECUT1基因序列全长12 072 bp，大部分内含子区域在试验中未检测到，内含子区域的序列变异，以及变异与品种特异性和该基因的功能关联还有待进一步深入研究。