不同药剂对茶赤叶斑病原菌的体外抑制效果

董照锋, 程光禄, 曹秀荣

(1.商洛市农产品质量安全检验检测中心， 陕西 商洛 726000； 2.镇安县达仁镇农业综合服务站， 陕西 镇安 711507)

商洛位于秦岭南麓，地处暖温带向亚热带过渡带，属于暖温带半湿润季风气候，是中国最北端茶区。特殊的生态环境、立地条件和耕作方式，形成了独特的有害生物群体。2016—2017年，笔者所在课题组对商洛茶区病虫害种类开展普查，弄清了茶树病虫害种类及主要病虫害发生规律[1]，相继开展茶云纹叶枯病、茶轮斑病、茶芽枯病的防治试验[2]。茶赤叶斑病(病原PhyllostictatheicolaPetch)是商洛茶园的重要病害，该病为高温高湿性的病害，在商洛常年5—6月发病，盛发期为7—8月，夏季高温干旱、秋天多雨有利于病害的发生流行。目前，对该病防治技术研究的文献较少，胡淑霞等[3-4]研究表明，茶树益微TBM对茶赤叶斑病的抑制可达到66.28%，500倍多抗霉素对茶赤叶斑病的抑制率为51.90%。王瑾等[5]研究表明，糖苷类和顺-3-己烯醇、水杨酸甲酯、苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇氧化物、香叶醇和芳樟醇7类物质对茶赤叶斑病菌都有明显的抑制作用，其中香叶醇的抑制作用最强，抑制率和物质浓度有着明显的线性关系。张华艳[6]研究表明，咖啡碱对茶赤叶斑病具有明显的抑制，当咖啡碱浓度在1～10 mg/mL,其抑制率为33.0%～100%。为有效控制茶赤叶斑病的危害，选取武夷菌素、多抗霉素、枯草芽孢杆菌、春雷霉素、戊唑醇5种药剂开展茶赤叶斑病病菌的体外抑制试验，筛选优质、高效、低残留的农药，以期为大田防治茶赤叶斑病提供有效依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 药剂 2%武夷菌素AS，山东潍坊万胜生物农药有限公司，2018年5月10日生产；3%多抗霉素AS，绩溪农华生物科技有限公司，2018年3月1日生产；6%春雷霉素WP，山东利邦农化有限公司，2018年6月23日生产；100亿芽孢/g枯草芽孢杆菌WP，德强生物股份有限公司，2018年2月22日生产；430 g/L戊唑醇SC，西安鼎盛生物化工有限公司，2018年1月2日生产。

1.1.2 培养基 1) 茶叶粉PDA培养基：自来水1 000 mL、马铃薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、茶叶粉(80目)15 g、琼脂粉15 g。2) 清水琼脂培养基：自来水1 000 mL、琼脂粉15 g。

1.1.3 菌种 供试的病原菌由商洛市农产品质量安全中心实验室提供，于2017年10月23日从山阳县漫川镇娘娘庙村贺家岭万福茶厂千亩有机茶园采集的典型症状新鲜病叶，进行室内分离、培养、鉴定后于4℃保存，每3个月对菌种活化1次。

1.2 方法

1.2.1 培养基的筛选 采用直接测量法测定菌落直径，筛选最适宜的培养基。把菌种分别接种到PDA、茶叶粉5 g/L+PDA、茶叶粉10 g/L+PDA和茶叶粉15 g/L+PDA 4种培养基上。通过测量不同培养基菌丝直径选出最适宜的培养基。

1.2.2 药剂试验设计 试验共6个处理，4次重复，不同处理浓度按照药剂使用说明推荐用量确定。处理1：430 g/L戊唑醇SC 90 μg/mL；处理2：6%春雷霉素WP 100 μg/mL；处理3：枯草芽孢杆菌WP 500万芽孢/mL；处理4：2%武夷菌素AS 40 μg/mL；处理5：3%多抗霉素AS 60 μg/mL；处理6(CK)：灭菌水对照。将茶赤叶斑病菌丝或孢子接种于不同处理配置的含药培养基中，于25℃、湿度90%恒温恒湿条件下培养，测定5种药剂对茶赤叶斑病菌丝及分生孢子的抑制效果。

1.2.3 药剂对茶赤叶斑病菌丝及分生孢子抑制效果的测定 采用菌丝生长速率法[7-8]测定5种供试药剂对菌丝的抑制作用。采用孢子萌发法[9-10]测定5种供试药剂对孢子萌发的抑制作用。

1.2.4 含药培养基制备及菌丝接种 为避免培养基快速冷却，确保每个培养皿中可以加入足够多的含药培养基，在实际操作时，各处理一次性多配制2份含药培养基。先将5个药剂处理按照以下浓度配置，430 g/L戊唑醇SC 900 μg/mL、6%春雷霉素WP 1 000μg/mL、枯草芽孢杆菌5 000万芽孢/mL、2%武夷菌素AS 400 μg/mL、3%多抗霉素AS 600 μg/mL。准备好已灭菌的烧杯、培养皿、PDA培养基，无菌环境下用10 mL一次性注射器注入稀释好的药液6 mL于100 mL烧杯中，当PDA培养基冷却到500C左右时，再向烧杯中注入培养基54 mL，多次推拉注射器让药液充分混合均匀，最后用一次性注射器向9 cm培养皿中注入含药培养基10 mL，制成含药平板培养基，此时药剂浓度为原浓度1/10。空白对照组为6 mL灭菌水和54 mL茶叶粉PDA培养基[11]。

选取在25℃、湿度90%恒温培养5 d的活化菌种，在菌落周边生长茂盛、均匀一致处用打孔器制备直径6 mm菌饼，每皿1块，植入茶叶粉PDA平板培养基中间位置，接种完毕，将各处理置入25 ℃、湿度90%恒温恒湿条件下培养，分别于72 h、96 h、120 h、144 h、168 h用十字交叉法测量各皿菌落直径，计算菌丝生长拟制率。

菌丝生长抑制率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径) ]×100%

1.2.5 孢子悬浮液制备及接种 取蒸馏水600 mL于1 000 mL烧杯中，用棉塞塞好并用绳子包扎好于121℃高压蒸气灭菌30 min，保存备用。选用培养好的茶赤叶斑病原菌(培养20 d，已产生分生孢子)平板培养物1～2皿，在无菌环境下，用一次性注射器注入10 mL灭菌水。用一次性接种铲轻刮菌落表面，用力按压分生孢子器让其破裂。将2张擦镜纸放在灭过菌口径为7 cm的小漏斗上，将孢子悬浮液过滤在灭菌的50 mL锥形瓶内，重复过滤2次。在显微镜下观察孢子悬浮液的孢子量，加灭菌水调节孢子浓度，当每个视野能观察到80～100个孢子时，孢子悬浮液制备完成[12]。

分生孢子采用水琼脂培养法。为避免培养基快速冷却，各处理制成4份含药培养基。用一次性注射器吸取稀释好的药液4 mL于100 mL已灭菌的烧杯中，加入经高压蒸气灭菌并冷却到50 ℃左右的清水琼脂培养基36 mL，让药液充分混合均匀，然后用一次性注射器吸取10 mL含药培养基2份，分别注入2个灭菌的9 cm培养皿中，制成含药平板培养基。空白对照组为4 mL灭菌水和36 mL清水琼脂培养基，按上述方法制作2个对照平板培养基。平板培养基制好后，在每个培养皿背面用记号笔画3个小圆圈标记孢子悬浮液滴入点位置以便观察。在3个小圈内，每点滴1滴孢子悬浮液，即为3次重复。将各处理置于25 ℃、湿度90%恒温恒湿条件下培养，在对照组80%～90%孢子萌发时，将对应处理组全部取出立即放入4 ℃冰箱冷藏，终止孢子继续萌发。然后逐一取出镜检统计各处理孢子萌发情况。每个点(即1个重复)检查3个视野，并对孢子萌发状况进行显微拍照。

孢子萌发率=(孢子萌发数量/观察孢子数量)×100%

孢子萌发抑制率=[(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/ (对照孢子萌发率) ]×100%

1.2.6 杀菌剂不同浓度处理对菌丝的抑制试验 根据不同药剂对茶赤叶斑病菌丝和分生孢子的抑制效果，筛选出抑菌效果较好的武夷菌素、枯草芽孢杆菌2种药剂进行浓度梯度试验，测定筛选药剂的抑制作用。

1) 不同浓度武夷菌素对菌丝的抑制作用。试验共设置6个处理，各处理4次重复。处理A：65 μg/mL；处理B:40 μg/mL；处理C:30 μg/mL；处理D:20 μg/mL；处理E:10 μg/mL；处理F(CK)：灭菌水对照。含药培养基的配制参照1.2.4进行。

1.4 观察指标 ①根据Barthel指数和Harris髋关节评分比较患者干预前后功能康复情况［2］。②根据视觉模拟疼痛评分（VAS评分）比较患者干预前后疼痛程度［3］。③根据焦虑自评量表（SAS评分）、抑郁自评量表（SDS评分）比较患者心理状态［4］。

2) 不同浓度枯草芽孢杆菌对菌丝抑制作用。试验共设置6个处理，4次重复。处理a:500万芽孢/mL；处理b:400万芽孢/mL；处理c:300万芽孢/mL；处理d:200万芽孢/mL；处理可e:100万芽孢/mL；处理f(CK)：灭菌水对照。含药培养基的配制参照1.2.4进行。

2 结果与分析

2.1 适宜培养基

在温度25℃，湿度90%条件下培养168 h，PDA 培养基、茶叶粉5 g/L+PDA培养基、茶叶粉10 g/L+PDA培养基和茶叶粉15 g/L+PDA培养基4个处理的茶赤叶斑病菌的菌落直径分别为45.4 mm、49.3 mm、43.9 mm和44.8 mm，经差异显著性分析，茶叶粉5 g/L+PDA培养基的菌落直径极显著高于其余处理，该处理的菌落生长最快、长势最好。因此，茶叶粉5 g/L+PDA培养基为最优组合，后续的试验采用该培养基组合。

2.2 5种杀菌剂对茶赤叶斑病菌丝的抑制作用

从表1可知，处理1的抑制作用持久、稳定、效果最好，72～168 h抑制率均为100%。处理3对菌丝抑制效果随着处理时间的延长呈增强趋势，在168 h的抑制率达94.43%。处理4在72～168 h抑制作用比较稳定，抑制率为66.21%～69.57%。处理2和处理5的抑制作用较差。72～168 h，处理2和处理6(CK)的抑制作用差异均不显著，与其余处理间的差异极显著，处理1、3、4、5间的差异极显著。

2.3 5种杀菌剂对茶赤叶斑病菌分生孢子的抑制作用

从表2看出，接种后22 h，处理6(CK)的孢子萌发率为55.07%。5个药剂处理中，处理2对茶赤叶斑病菌分生孢子的抑制效果最好，抑制率为89.01%，萌发率为6.05%，与其余处理差异极显著。处理5、处理1、处理3和处理4对茶赤叶斑病菌分生孢子的抑制率分别为47.90%、29.96%、28.57%和5.36%，抑制作用较差。处理2与其余处理分生孢子萌发率的差异达极显著水平，处理1和3、处理4和6间差异不显著。

表1 5种杀菌剂对茶赤叶斑病菌丝的抑制率

注：同列不同大小字母分别表示0.01、0.05水平差异显著，下同。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate different difference at 0.01 and 0.05 levels respectively. The same below.

表2 5种杀菌剂对茶赤叶斑病菌分生孢子的抑制作用(接种22 h)

2.4 不同浓度武夷菌素和枯草芽孢杆菌对茶赤叶斑病菌丝的抑制作用

2.4.1 武夷菌素 从表3可知，5个浓度武夷菌素随着时间的推移对茶赤叶斑病菌丝的抑制率呈逐渐下降趋势，均在用药72 h的抑制率最高，处理A、B和 C的抑制率都在60%以上。168 h 时，处理A、B、C、D、E的抑制率分别为69.55%、59.32%、48.82%、41.47%和35.70%，处理A的菌落直径与其余处理差异极显著。总体而言，高浓度的武夷菌素对菌丝抑制效果较好，但已超出了推荐使用的浓度。

表3 不同浓度武夷菌素和枯草芽孢杆菌对茶赤叶斑病菌丝的抑制率

2.4.2 枯草芽孢杆菌 5个浓度的枯草芽孢杆菌对茶赤叶斑病菌丝的抑制率随着时间的推移呈增强趋势，在168 h达到最高。在168 h，处理a、b、c、d和e对茶赤叶斑病菌丝的抑制率分别为94.49%、93.96%、93.44%、93.44%和92.39%，都具有较好的抑制作用。且5个处理的菌落直径与对照差异极显著，处理a和处理b差异不显著；处理b、c和d间差异不显著，与处理e差异显著。

3 结论与讨论

茶赤叶斑病菌的最佳培养基为茶叶粉5 g/L+PDA。430 g/L戊唑醇SC 90 μg/mL对茶赤叶斑病菌丝抑制作用最明显，对病害控制见效快、效果明显，在72～168 h抑制率均为100%。500万芽孢/mL和400万芽孢/mL枯草芽孢杆菌对菌丝抑制率达94.49%和93.96%，两者之间差异不显著。2%武夷菌素AS 65 μg/mL对菌丝抑制率为69.55%，也具有较好的抑制作用。6%春雷霉素WP 100 μg/mL对孢子抑制效果最好，22 h时抑制率达89.01%。春雷霉素主要用于茶赤叶斑病的早期预防，戊唑醇和枯草芽孢杆菌用于发病茶园的防治。对于茶赤叶斑病重发茶园，建议使用430 g/L SC戊唑醇90 μg/mL与6%春雷霉素WP 100 μg/mL混配进行防治。董照锋[12]研究表明，春雷霉素与枯草芽孢杆菌混配会降低枯草芽孢杆菌对菌丝的抑制作用，建议在茶赤叶斑病重发茶园防治时可采用400万芽孢/mL枯草芽孢杆菌与6%春雷霉素WP 100 μg/mL间隔10～15 d交替使用。

在试验中90 μg/mL戊唑醇430 g/L SC抑制率达100%，由于试验浓度远低于推荐使用浓度，因此未对其开展梯度试验。试验发现，多抗霉素水剂对茶赤叶斑病的分生孢子有致畸作用，其畸形率达16.66%，主要表现为芽管明显偏短，部分芽管严重畸形，局部膨大似水葫芦状，关于其机理还需要进一步试验研究。虽然高浓度的武夷菌素对茶赤叶斑病菌丝抑制作用较好，由于超出了推荐使用浓度，生产中不建议使用。茶赤叶斑病原菌体外抑制试验是在实验室进行的，因此，筛选出的防治药剂或配方还需大田进一步试验。