响应面优化超声波辅助提取金耳多糖的研究

蒋 益 郑惠华 刘广建 薛 璟* 季宏更 张蕾

（1江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡214063；2江苏安惠生物科技有限公司，江苏南通226009）

金耳（Tremellaaurantialba）又称脑耳、黄木耳等，隶属银耳科、银耳属，为我国特有的一种珍稀食药用菌[1]。金耳胶质细腻，清润可口，中医认为其有化痰、止咳、定喘、调气、平肝阳之功效[2]。金耳多糖是金耳的主要活性成分之一，研究证实金耳多糖具有调节机体免疫能力、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗辐射等多种药理活性[2]。金耳菌种为复合菌种，金耳多糖按提取来源不同分为子实体多糖、菌丝体多糖、发酵液胞外多糖和酵母状分生孢子多糖。在潮湿条件下，金耳成熟的担孢子容易类似酵母菌那样以芽殖方式产生大量酵母状的分生孢子，这种分生孢子能以芽殖的方式不断增殖[3]，因而可以利用金耳酵母状分生孢子发酵生产多糖。在适宜条件下得到恒定的多糖成分，且具有周期短、成本低、不受季节的影响、可大规模工业化生产等优点。因此，以液体发酵金耳分生孢子提取多糖具有广泛地开发应用前景和科学意义。

目前食药用菌多糖的提取方式主要有水提醇沉法、酸碱浸提法、酶法、超声波法、微波法和超临界流体萃取法等。单纯用水浸提时间长，效率低[4]；酸碱提取易引起糖降解及糖甘键断裂，从而破坏多糖活性结构[5]。水解酶的价格高、易失活，在生产上应用困难[6]。超声波法是利用超声波的空化效应增加溶剂穿透力，提高细胞内组分的溶出速度和溶出次数；该法既可以在常温下较温和地将食药用菌细胞分解、保持细胞组分的生物活性，又可较大幅度提高多糖等有效成分的提取率[7]。近年来，超声波辅助提取技术在多糖提取工艺领域得到了广泛的应用，其中，在虫草花多糖[8]、银耳多糖[9]、猴头菇多糖[10]、杨树口蘑多糖[11]等食药用菌多糖的提取中成功应用。

因此，笔者以液体发酵金耳酵母状孢子及其发酵液为材料，采用超声波辅助热水浸提法提取金耳多糖，在单因素试验的基础之上，运用响应面统计分析软件优化多糖提取工艺，以期为金耳多糖的进一步开发利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

（1）供试金耳菌株菌株：金耳酵母状分生孢子菌株TAY6048，由江苏省苏微微生物研究有限公司提供，改良PDA培养基4℃保存。

（2）培养基：改良PDA培养基为马铃薯200g煮汁，葡 萄 糖20g，KH2PO41g，MgSO40.5g，加 水1000mL，琼脂粉20g，pH自然。金耳种子培养基：蔗 糖10g，葡 萄 糖20g，酵 母 膏2g，蛋 白 胨2g，KH2PO41g，MgSO40.5g，加水1000mL，pH自然。发酵培养基为玉米粉30g，豆饼粉10g，蔗糖5g，KH2PO41g，MgSO40.5g，加水1000mL，pH自然。

（3）主要设备：PL203型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SG78型数字pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GKC214恒温水浴锅，上海苏达实验仪器有限公司；JB90-D搅拌器，上海标本模型厂；TDL-40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；TS-2102型双层恒温摇床，上海梦蓝仪器设备有限公司；DHG-9245A型恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；JY98-ⅢDN超声波细胞粉碎机，宁波新艺超声设备有限公司；721分光光度计，上海光学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 液体发酵

将活化好的斜面菌种接种于金耳种子培养基中，25℃，150r/min振荡培养3d后以5%的接种量转接500mL发酵瓶，每瓶液体量为100mL，25℃、150r/min振荡培养4d。

1.2.2 多糖提取与制备

按照试验设计的超声条件提取，然后在90℃水浴下浸提4h，8000r/min离心10min，取上清液，浓缩至原体积1/5，加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀后置于4℃冰箱过夜。第2天取出8000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀，冻干即为粗多糖。称取质量，硫酸-蒽酮法[12]测沉淀多糖含量。此多糖为胞外多糖和胞内多糖之和，将其换算为单位发酵体积的多糖提取量（g/L）。

1.2.3 金耳多糖提取单因素试验

以单位发酵体积金耳多糖提取量为指标，分别考察超声功率、超声时间、超声温度对金耳多糖提取量的影响。每组试验重复3次。

1.2.3.1 超声功率

设定超声时间15min，超声温度40℃，设定超声功率200、300、400、500、600、700W，考察不同超声功率对金耳单位发酵体积多糖提取量的影响。

1.2.3.2 超声时间

设定超声功率500W，超声温度40℃，分别设定不同的时间5、10、15、20、25、30min提取，考察不同超声时间对金耳单位发酵体积多糖提取量的影响。

1.2.3.3 超声温度

设定超声功率500W，超声时间15min，设定温度分别为35、40、45、50、55、60℃，考察不同超声温度对金耳单位发酵体积多糖提取量的影响。

1.2.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以单位发酵体积金耳多糖提取量为响应值，以超声功率（A）、超声时间（B）和超声温度（C）为试验因素，设计三因素三水平的Box-Benhnken中心组合试验（表1），对金耳多糖超声辅助提取工艺进行优化。

1.2.5 数据处理

试验数据使用Excel进行整理和绘图；同时利用Design-Expert8.0统计分析软件进行多元二次回归模型方程的建立及方差分析，运用该软件中响应面值优化程序求得当响应面值最大时各因素的最佳组合。

表1 响应面试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声功率对金耳多糖提取量的影响

由图1可以看出，在其他条件相同的情况下，当超声功率为200W时，多糖提取量比较低；当超声功率超过200W低于500W区间内，多糖提取量随着超声功率的增加而提高；当超声功率超过600W多糖提取量下降明显。因此选择350W、450W、550W作为中心组合试验的三个水平。

图1 超声功率对金耳多糖提取量的影响

图2 超声时间对金耳多糖提取量的影响

2.1.2 超声时间对金耳多糖提取量的影响

由图2可以看出，在其他提取条件相同的情况下，超声时间在5～20min内，多糖提取量随着超声时间的延长，逐渐增加，超过20min，随着超声时间的延长，多糖提取量缓慢下降。原因可能是在试验条件下随着时间延长溶液温度会升高，过长的超声时间使得粗多糖中的糖蛋白组分缓慢变性析出，后期的高速离心使糖蛋白以不溶的沉淀状物质分离出来；另外，随超声时间的延长可能还会造成多糖的逐渐降解。因此，选择超声时间10、15、25min作为中心组合试验的三个水平。

2.1.3 超声温度对金耳多糖提取量的影响

由图3可以看出，在其他提取条件相同的情况下，随着超声温度地提高，多糖提取量上升迅速，温度45℃时，达到最高值，之后随着提取温度的上升，多糖提取量下降，当温度超过50℃时，降速加快。一般来说，溶液温度的升高，会增加溶剂分子和溶质分子的运动，促进扩散作用，从而有利于提高多糖提取率，但是温度过高有可能破坏有效成分，降低多糖活性，蛋白质等杂质的析出也将增加，会对后续处理带来不便。因此，选择超声温度40、45、50℃作为中心组合试验的三个水平。

图3 超声温度对金耳多糖提取量的影响

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面优化试验结果

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Benhnken设计原理，以超声功率、超声时间、超声温度3个因素为自变量，以金耳单位发酵体积多糖提取量为响应值，采用响应面法进行三因素三水平的试验设计，共包括17组试验方案，试验设计方案及结果见表2。

2.2.2 模型建立与方差分析

利用设计软件Design-Expert对表2数据进行多元回归拟合，获得超声功率（A）、超声时间（B）、超声温度（C）的二次多项回归方程：

Y=2.86+0.033A+0.011B+0.079C+0.012AB++0.023AC+0.015BC-0.17A2-0.062B2-0.082C2，此回归模型方程的ANOVA分析结果见表3。

由表3可以看出，回归模型的P值小于0.0001，说明该二次回归模型是极显著的；失拟项P为0.1341，P大于0.05，差异不显著，未知因素对试验结果干扰小，说明残差均由随机误差引起；由F值可以看出3个因素对金耳多糖提取的影响程度由大到小依次为超声温度（C）＞超声功率（A）＞超声时间（B）。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

表3 响应面试验回归模型方差分析

同时，模型相关系数R2=0.9925，表明有99.25%的数据可用此方程来解释，能够较好地反应金耳多糖提取的变化；模型的调整相关系数R2Adj=0.9828，说明拟合模型方程可靠，有很高的可信度。综上所述，该二次回归模型拟合程度好，试验误差较小，可用该模型方程对金耳多糖提取条件进行预测和分析。

2.2.3 响应面分析

根据回归模型，利用Design-Expert8.0.6软件绘制响应面分析图和等高线图（图4），从响应面分析图中可以看出各因素交互作用对金耳多糖提取的影响。对金耳多糖提取量影响越大的因素，其曲线走势会相对越陡。在等高线图中，各因素对金耳多糖提取的影响体现在其轴向等高线的密集程度上，轴向等高线越密集，说明该因素对金耳多糖提取的影响越显著。通过比较图4中响应面分析图和等高线图可以看出：超声时间（B）与超声温度（C）两因素之间的交互作用对金耳多糖提取的影响较为显著，而其他因素两两之间的交互作用对金耳多糖提取的影响较小。

图4 各两因素交互作用对金耳多糖提取影响的响应面图及等高线图

2.2.4 最佳条件的确定及验证

通过Design-Expert8.0.6软件分析得到超声波辅助提取金耳多糖的最佳工艺条件，即超声功率518W、超声时间16min、超声温度50℃，此条件下多糖单位发酵体积提取量为2.85g/L，模型预测值为2.88g/L，模型预测值与实测值相比，相对误差为1.05%。说明试验建立的二次多项回归方程能够有效地反应各因素对金耳多糖提取的影响，用响应面法优化回归方程模型可行，具有实际可操作性。

3 结论

响应曲面法，采用了合理的试验设计，能以很少的试验数量和时间对试验进行全面研究，从而快速有效地确定多因素系统的最佳条件，并拟合出相应模型，近年来被广泛应用于众多生产加工条件的优化控制[13]。诸多研究表明，超声波功率、超声温度、超声时间是多糖类物质提取的主要影响因素。通过响应面分析，获得金耳多糖超声波辅助提取的最佳条件为：超声功率518W、超声时间16min、超声温度50℃。在此优化条件下，进行3次重复验证试验的平均多糖提取量为2.85g/L，与预测值误差较小，说明经响应面优化后的试验条件具有实际意义；同时，也表明该模型设计合理，对金耳多糖的最佳提取工艺具有现实指导作用。