马铃薯脱毒技术研究进展

施夏明，齐璐璐，乔宁宁，徐忠东，耿明

（1.合肥师范学院，安徽合肥230601；2.安徽大学，安徽合肥230039）

马铃薯（Solanum tuberosumL.）是无性繁殖作物，病毒和类病毒可通过种薯持续传播给子代植株[1]，这是制约马铃薯现代农业生产，导致产量和质量下降的主要因素。马铃薯X病毒（PVX）、Y病毒（PVY）、S病毒（PVS）、卷叶病毒（PLRV）、M 病毒（PVM）、A病毒（PVA）在我国及世界各地广泛流行。我国马铃薯主产区PVS、PVY感染情况尤为严重[2]。马铃薯病毒脱毒技术对于提高马铃薯产量和质量至关重要。现行的马铃薯脱毒技术主要包含茎尖分生组织培养法、热疗法、电疗法、化学疗法、冷冻疗法。单独或联合使用上述方法，均取得了良好的脱毒效果。笔者综述了国内外马铃薯脱毒技术的发展现状，为马铃薯脱毒技术的研究和推广提供参考。

1 茎尖脱毒培养技术

植物病毒通过在维管系统中的快速移动来侵染健康组织，而在未形成成熟维管系统的分生组织中，病毒只能在胞间连丝上缓慢传输来侵染组织[3]。此外，细胞分裂和病毒复制存在激烈竞争。在分生组织中，细胞分裂非常旺盛，需要消耗大量养分，而病毒复制由于得不到充足的营养而受到明显抑制[4]。因此，植物的分生组织不含病毒。将植物的分生组织分离出来，进行组织培养即可得到无病毒的脱毒苗。茎尖分生组织脱毒培养技术是应用最为广泛的一种脱毒方法。近年来，马铃薯茎尖脱毒技术的发展研究主要集中在不同产区、不同品种的茎尖脱毒培养基配方及茎尖剥离方式上[5-7]。茎尖脱毒培养基配方研究除了聚焦使用什么样的激素及其配比来提高脱毒茎尖成活率外，还关注如何提高脱毒茎尖的成苗率。齐恩芳等在茎尖脱毒培养基中添加了0.05%活性炭，茎尖成苗时间提前了13 d，成苗率提升了7.5%[8]。卢艳丽等在茎尖培养基中添加了L-半胱氨酸盐酸盐，显著抑制了组织褐变，且提高了成苗率[9]。

2 热疗法脱毒培养技术

热疗法的2个重要影响因素是温度和热疗时间。热疗的原则是不损伤植物组织，但可以使植物病毒的衣壳蛋白变性，从而最大限度地杀死病毒。此外，热疗法还可能通过预防病毒向分生组织细胞运动、抑制病毒复制、降解病毒RNA、促进病毒RNA沉默、减少茎尖中病毒基因组积聚等方式来实现植物脱毒[10]。热疗法对马铃薯卷叶病毒最敏感[11]。Abbas等利用37℃热水浸泡马铃薯块茎2～3 h后，转入大田播种，卷叶病毒发病率降至最小16.66%[12]。热疗法对其他马铃薯病毒，例如PVX、PVS也具有不同程度的抑制作用[13]。热疗法常常配合茎尖分生组织培养，可以显著提高脱毒效率[10]。蒋瑜等对国际马铃薯中心提供的编号B13-6的发芽马铃薯块先进行37℃热疗30 d，然后进行茎尖脱毒培养，结果显示热疗可提高脱毒效果[14]。冯光惠等对含有PVX、PVY、PLRV、PSTVd（马铃薯纺锤形块茎类病毒）4种病毒的费乌瑞它、夏波蒂马铃薯无菌苗先进行每天38℃热疗4 h，持续4周，然后进行茎尖脱毒培养，结果表明PLRV的脱除率均达到100%，PVX的脱除率均达到65%以上，PVY的脱除率均达到90%以上，最难脱除的类病毒PSTVd的脱除率也达到8%以上[15-16]。尹明华等采用茎尖培养与热疗法反复交互进行，成功脱除了怀玉山地区高山马铃薯的PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV 病毒[6]。

3 电疗法脱毒培养技术

电疗法是一种高效、简便、快速的脱毒技术方法。其通常将马铃薯茎尖、茎段、芽等外植体置于5～100 mA 的电流下，通电处理 5～25 min，然后移入培养基中培养，即可在不影响外植体再生率的基础上，较好地脱除病毒。电疗法脱病毒的原理可能是通过电脉冲加热植物组织，使病毒的核酸变性，从而达到杀灭病毒的疗效[17-18]。马铃薯电疗法脱毒技术在我国的运用并不多见，而在国外，此技术方法的运用较为广泛。国外学者运用此方法已成功脱除PVX[17，19]、PVY[20-23]、PLRV[23-24]、PVA[21]、PSTVd[24]。

4 化学疗法脱毒培养技术

化学疗法脱毒培养技术采用的化疗药物最常见的是利巴韦林。利巴韦林在1972年被人工合成，试验证据表明其可以抑制大多数动物RNA病毒和DNA病毒的复制，是高效的抗病毒药物[25]。1982年Klein等为了获取无PVX种苗，利用添加了利巴韦林的液体培养基来培养马铃薯茎尖，结果显示10 μg/mL利巴韦林可以脱除80%～83%茎尖的PVX，6～8个月后茎尖发育成完整的植株。但是各种浓度的利巴韦林对植物生长均可产生毒害作用，当利巴韦林的浓度达到 100 μg/mL 时，致死茎尖[26]。2008 年 Dhital等利用添加了20 mg/L利巴韦林的MS培养基培养电疗过后的马铃薯茎尖，相对于单一电疗法，显著增加了PLRV和PVY的脱毒率[23]。2014年Yang等将各自感染了 PVA、PLRV、PVS、PVX、PVY 的马铃薯小植株和混合感染了PVM、PVS、PVY的马铃薯小植株培养在含有不同浓度利巴韦林的MS培养基中，经过2～3代的继代培养，发现75～150 mg/L利巴韦林可以高频获取脱毒种苗[27]。2015年Singh等将PLRV阳性的马铃薯外植体培养在含有5～30 mg/L利巴韦林的MS培养基中，结果显示随着利巴韦林浓度的增加，马铃薯植株的再生率显著降低，脱毒率显著增加，当利巴韦林浓度达到25 mg/L时，再生率和脱毒率达到了最佳组合，再生率达到36.80%，脱毒率达到39.62%[28]。2017年Kushnarenko等将马铃薯茎尖冷冻处理后，再用含有利巴韦林的培养基培养3代，获得了100%无毒马铃薯苗[29]。以上研究表明利巴韦林对广泛流行的6种马铃薯病毒均有不同程度的抑制作用。

化学疗法脱毒技术采用的化疗药物除了利巴韦林外，还有一些其他药物的应用实例，例如1 000 mg/L乳铁蛋白通过喷雾法或者联合组织培养法可有效抑制PVX[30]。富含25 mg/L 2-硫尿嘧啶的MS培养基培养卷叶病毒阳性的马铃薯外植体，可得到30.55%的再生率和38.68%的脱毒率[28]。此外还有些化疗药物在脱毒的同时帮助提升植株的再生率，例如水杨酸预处理联合冷冻疗法可增强马铃薯植株的存活率并可清除PVS[31]。水杨酸联合利巴韦林和电疗法在有效清除PLRV和PVY的同时，显著提升马铃薯苗的再生率，最高达72.7%[23]。

5 冷冻疗法脱毒培养技术

相对于传统的茎尖脱毒培养技术，冷冻脱毒培养是一种更高效、更简便的脱毒培养技术[32]。植物病毒量会随着离顶端分生组织距离的减小而减少。顶端分生组织的细胞含有高浓度胞质，而距离分生组织较远的茎尖细胞含有较多水分。在-196℃的冰冻条件下，水分含量大的细胞会被胞内形成的冰晶崩解，而拥有高浓度胞质的细胞可以抵抗冰冻。因此，低温疗法是基于超低温对细胞选择性破坏的原理，杀死带有病毒且水分含量大的茎尖细胞，保存不含病毒或含少量病毒的分生组织细胞，结合组织培养技术，而得到无毒种苗[33-34]。目前，国内外科学家已采用马铃薯冷冻疗法脱毒技术成功高效脱除了PVM、PVX、PVY、PVS、PLRV、PSTVd[29，31，35-39]。

6 结语

马铃薯品种繁多，马铃薯病毒的种类亦繁多。每一品种马铃薯感染的每一种病毒对每一种脱毒技术的敏感性均有不同，这就需要研究者深入寻找最佳的脱毒方案。此外，每一种脱毒技术均具有一定的局限性，需要研究者联合2种或更多种的脱毒技术同时干预马铃薯病毒，使脱毒技术间优势互补，才能获得理想的马铃薯脱毒种质。例如，科学家运用茎尖分生组织脱毒技术、冷冻脱毒技术、化学疗法联合热疗法脱毒技术分别对挪威当地8种传统栽培品种马铃薯进行脱毒试验，结果发现其中4个品种的马铃薯通过茎尖分生组织脱毒技术脱除病毒，没有1个品种的马铃薯通过冷冻脱毒技术脱除病毒，而8个品种的马铃薯均通过化学疗法联合热疗法不同程度地脱除了病毒[40]。

马铃薯是全球第4大粮食作物，我国是最大的马铃薯生产国[41]。我国已启动马铃薯主粮化战略。马铃薯种质资源的脱毒情况严重影响我国马铃薯的产量和品质及粮食安全。因此，简便易行、安全高效、脱毒周期短的脱毒技术研究和推广是马铃薯主粮化战略的必然要求。