FEZF1-AS1在恶性肿瘤中的表达及调控作用研究

周原世,徐书婉,夏浩明综述 姜兴明审校

2018年全球癌症生存趋势监测报告显示，肿瘤依然是全球亟待解决的重要公共卫生问题[1]。近几年非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA)与肿瘤的关系成为研究的热点，根据ncRNA的长度，将其分为微小RNA和长度大于200 nt的长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)[2-3]。LncRNA能够在转录、翻译、染色质修饰及蛋白质激活等分子生物学过程中发挥重要作用，调控基因的表达，影响肿瘤的发生发展[4-6]。近年来的研究发现，lncRNA不仅能够调控肿瘤的发生发展，而且在肿瘤的诊断治疗等方面有着潜在的应用[7-10]。FEZF1-AS1(Fez family zinc finger protein 1-antisense RNA 1)作为一种新发现的lncRNA，在多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的发生发展密切相关，在肿瘤的基因诊断、治疗和预后评估等方面有着潜在的应用前景。文章就FEZF1-AS1在肿瘤发生发展中的作用机制及研究前景作一综述。

1 FEZF1-AS1概述

FEZF1-AS1定位于人类染色体7q31.32区域，全长6 420 nt，由7号染色体正链，即它的同源基因FEZF1( Fez family zinc finger protein 1 )的相反链转录而来，包含7个外显子且具有相对保守的序列，且FEZF1-AS1第一个外显子和FEZF1的外显子1之间有611个核苷酸互补配对[6]。同时，研究发现，FEZF1-AS1有3种剪接变异体，分别是FEZF1-AS1-201 (679 bp, 1 exon)、 FEZF1-AS1-202 (2 653 bp, 3 exons)、 FEZF1-AS1-203 (768 bp, 1 exon) ，但是它们都不具有编码蛋白质的能力。HPA(Human Protein Atlas project)项目对人类正常组织进行RNA测序发现，FEZF1-AS1在人类的睾丸和脑组织中表达水平居高[11]。目前已有的研究表明，FEZF1-AS1主要分布于胞核中，胞质中仅有少量分布，但是不管分布于哪里，它都发挥着重要的功能：FEZF1-AS1可以通过ceRNA(competitive endogenous RNA)模式或者招募多梳抑制复合体(polycomb repressive complex, PRC)等方式调节基因的表达及蛋白质磷酸化等分子生物学过程，调控肿瘤的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为，对肿瘤的发生发展产生重要的影响[12-13]，也将在肿瘤的诊断、治疗及患者的预后评估中发挥重要的作用。

2 FEZF1-AS1与消化系统肿瘤

2.1 FEZF1-AS1与结直肠癌 Chen等[14]利用qRT-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction)测得34组结直肠癌(colorectal carcinoma, CRC)肿瘤组织中FEZF1-AS1较癌旁正常组织明显高表达；原位杂交实验及统计学分析显示，FEZF1-AS1的过表达与CRC的T分期、淋巴结转移和远端转移密切相关。细胞学实验发现：抑制FEZF1-AS1的内源性表达能够明显地减少HCT116和M5细胞的增殖；敲低FEZF1-AS1导致G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低，而凋亡细胞的比例变化不大，即FEZF1-AS1促进CRC细胞的增殖是通过调控细胞周期实现的，而非通过抑制凋亡；Matrigel侵袭实验及细胞划痕实验证实，沉默FEZF1-AS1能够明显地抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移；肺转移实验表明，FEZF1-AS1能抑制肿瘤在裸鼠体内的生长和转移；进一步实验发现，抑制FEZF1-AS1的表达降低了同源基因FEZF1 mRNA及蛋白质的表达，FEZF1-AS1和FEZF1的表达呈正相关。Kaplan-Meier分析表明FEZF1-AS1的高表达和患者的总体生存率密切相关；单变量及多变量分析证实FEZF1-AS1可以作为独立因子预测CRC的预后。Bian等[15]对FEZF1-AS1与结直肠癌的关系做了更为详细的研究，首先对CRC和正常结直肠组织进行基因芯片分析，最终筛选出52个在CRC组织中高表达，在正常结直肠组织中低表达的lncRNA，其中FEZF1-AS1表达尤为突出。CCk-8及克隆形成实验表明，沉默FEZF1-AS1导致CRC细胞的增殖和克隆受到显著抑制；流式细胞术结果显示高表达FEZF1-AS1促进了肿瘤细胞从G1到S期的推进，抑制了其凋亡；Transwell实验证实敲低FEZF1-AS1能够抑制HCT116细胞的迁移和侵袭；在裸鼠体内进行成瘤实验发现高表达FEZF1-AS1能够促进CRC的肺转移和肝转移。RNA pull-down实验及质谱分析预测出丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase 2, PKM2)是FEZF1-AS1相关蛋白，Western blot及RNA免疫沉淀实验(RNA immunoprecipitation, RIP)证实PKM2及其激活状态下均能够与FEZF1-AS1直接结合；进一步研究发现FEZF1-AS1能够在转录后水平上通过调节泛素化途径，阻碍PKM2的降解，延长PKM2的半衰期，增加它的稳定性，促进糖酵解的发生，进而加快肿瘤细胞的代谢；生物信息分析发现信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription3, STAT3)能够被FEZF1-AS1和PKM2所调节，后续实验证实FEZF1-AS1和PKM2均能促进STAT3的磷酸化，加快CRC的进展。同时，他们进行统计学分析也发现，FEZF1-AS1的高表达给患者带来了更差的预后。

2.2 FEZF1-AS1与胃癌 有研究指出[16]，过表达FEZF1-AS1能够促进MGC-803细胞的增殖；流式细胞术结果显示，抑制FEZF1-AS1的表达能够通过阻滞胃癌细胞停滞在G1期并诱导细胞发生凋亡；将Sh-FEZF1-AS1转染的SGC-7901细胞注入14只裸鼠皮下，2周后发现Sh-FEZF1-AS1组的肿瘤体积更小，质量更轻。RIP及RNA pull-down实验证实，FEZF1-AS1能通过结合组蛋白去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1, LSD1)在表观遗传学水平抑制P21的表达；染色质免疫沉淀实验(chromatin immunoprecipitation, ChIP)表明，LSD1能直接结合P21的启动子，诱导组蛋白第三亚基四号赖氨酸的二甲基(dimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit, H3K4me2)发生去甲基化，抑制p21的表达，促进胃癌的发生发展。Gu等[17]所在团队对3例胃腺癌患者的癌组织进行高通量测序获得lncRNA和mRNA在胃癌中的表达谱，确定lncRNAs/mRNAs在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达差异并构建lncRNA/mRNA共表达网络，同时利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库分析等方式进行验证，最终确定出9个对胃腺癌有潜在诊断价值的lncRNA，其中就包括FEZF1-AS1。Wu等[18]及其团队对104例胃癌组织和癌旁正常组织进行RNA测序并分析发现，FEZF1-AS1在胃癌组织中高表达，且FEZF1-AS1和胃癌分化程度及分期明显相关。生存分析和时序检验结果表明，FEZF1-AS1高表达的患者生存时间更短；受试者工作特征曲线分析证明，FEZF1-AS1对胃癌诊断来说可能是一个敏感度和特异度都相对较高的潜在标志。qRT-PCR测得MGC-803和MKN-49P中FEZF1-AS1稳定高表达，用si-RNA转染2种细胞，FEZF1-AS1表达下调，且2种细胞的生存能力明显降低；流式细胞术结果显示，沉默FEZF1-AS1导致肿瘤细胞停滞在G0/G1期，凋亡细胞数增多。Western blot实验结果表明，沉默肿瘤细胞中的FEZF1-AS1，β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表达显著减少，E-cadherin表达增加，即FEZF1-AS1可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌的发展。龚丹丹等[19]的研究也发现，FEZF1-AS1在胃癌SGC-7901细胞中过表达且能通过调控Wnt/β-catenin信号通路调节胃癌的进展。另有研究发现，FEZF1-AS1与胃癌的异时性肝转移密切相关[20]。目前看来，关于胃癌发生发展的研究从基因、RNA到蛋白繁杂多样[21]，这就使得胃癌发生发展的机制显得更为复杂，也让人们从多个方面了解胃癌。

2.3 FEZF1-AS1与肝细胞癌 Wang等[22]的研究指出，FEZF1-AS1在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)组织和细胞中明显高表达，且FEZF1-AS1的高表达和肿瘤的大小、TNM分期、血管侵袭及预后显著相关。细胞实验表明，沉默HCC细胞中的FEZF1-AS1，G0/G1期细胞比例上升，S期细胞比例下降，肿瘤细胞的增殖受到抑制，且HCC细胞的迁移、侵袭以及在裸鼠体内的生长都受到了明显抑制。Western blot实验证实，敲低FEZF1-AS1抑制了N-cadherin和Vimentin的表达，促进了E-cadherin蛋白的表达，抑制了肿瘤细胞的上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)进程；JAK/STAT3信号通路能够调节EMT进程，沉默FEZF1-AS1能够明显地抑制JAK2的表达和STAT3的磷酸化。上述实验表明，FEZF1-AS1能够通过调节JAK/STAT3信号通路加快EMT进程，促进HCC的发生发展。此外，肝细胞癌术后复发严重影响肝细胞癌患者的预后，是肝细胞癌治疗当中的疑难杂症[23]，目前还未有FEZF1-AS1在肝细胞癌术后复发中的研究报道，这值得进一步研究。

2.4 FEZF1-AS1与胰腺导管腺癌 Ye等[24]发现FEZF1-AS1在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)组织中明显高表达且过表达的FEZF1-AS1及其同源基因ZNF312B和PDAC的分化类型、高级别的AJCC分期、神经侵犯及较差的预后密切相关。免疫组化实验结果显示，ZNF312B高表达的PDAC组织，FEZF1-AS1也高表达，双变量分析证明两者之间呈正相关；下调FEZF1-AS1和ZNF312B能够明显地抑制PDAC细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭，且能够抑制肿瘤在裸鼠体内的生长；生物信息学分析发现miR-107能够靶向FEZF1-AS1和ZNF312B，从而提出FEZF1-AS1/miR-107/ZNF312B调控轴；并且还发现该调控轴对肿瘤细胞的Warburg效应维持具有重要作用。

3 FEZF1-AS1与生殖系统肿瘤

3.1 FEZF1-AS1与宫颈癌 Zhang等[25]利用RT-PCR测定发现，FEZF1-AS1在宫颈癌组织及细胞中明显高表达。将196例患者分为高表达组和低表达组，进行临床病理资料分析发现，FEZF1-AS1的过表达和高级别组织学分型、远端转移及晚期FIGO分期密切相关。在平均44个月的随访中，生存分析结果表明，FEZF1-AS1高表达的患者总体生存率更低，生存时间更短。单变量分析表明组织学分级、癌肿转移、FIGO分期和FEZF1-AS1的表达水平都与较差的预后相关，多变量分析证实FEZF1-AS1是宫颈癌预后的独立预测因子。

3.2 FEZF1-AS与卵巢癌 Zhao等[26]研究发现FEZF1-AS1在卵巢癌组织和细胞系中明显过表达，生存分析结果表明，FEZF1-AS1的过表达给卵巢癌患者带来了更差的预后。CCK-8实验结果证实，下调FEZF1-AS1的表达能够明显地抑制ES2细胞的增殖，诱导其凋亡的发生。进一步对FEZF1-AS1促进卵巢癌进展的机制进行研究发现，STAT3起到促进卵巢癌发生发展的作用，而过表达FEZF1-AS1能够促进STAT3的表达及磷酸化，抑制FEZF1-AS1的表达则对STAT3起到相反的的作用，即FEZF1-AS1能够通过促进STAT3的表达及磷酸化来激活JAK-STAT3信号通路促进卵巢癌的发生、发展。

4 FEZF1-AS1与肺癌

He等[27]研究者利用qRT-PCR测出FEZF1-AS1在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织和细胞中高表达；统计学分析还发现，FEZF1-AS1的高表达和淋巴结转移、低分化等级以及晚期TNM分期密切相关。用si-RNA干扰FEZF1-AS1在A549和SPC-A1中的表达，MTT及克隆形成试验表明，下调FEZF1-AS1的表达明显降低了肿瘤细胞的增殖能力；Transwell实验则证实，下调FEZF1-AS1的表达对肿瘤细胞的侵袭有着显著的抑制作用。Western blot实验结果表明，沉默NSCLC细胞中的FEZF1-AS1能够抑制转录因子Slug、Twist和Vimentin的表达，增加E-cadherin及ZO-1蛋白的表达，即FEZF1-AS1能够促进肿瘤细胞的EMT进程。RIP及ChIP实验发现，FEZF1-AS1能够直接结合 EZH2(enhancer of zeste homolog 2)和LSD1，而EZH2和LSD1能够与E-cadherin的启动子区域相结合发挥脱甲基作用，即沉默FEZF1-AS1能够上调E-cadherin的表达；此外，下调FEZF1-AS1的表达能够明显地增加Axin1的表达，减少β-catenin的表达，这表明FEZF1-AS1能够调节NSCLC中的Wnt/β-catenin信号通路，参与NSCLC的发生发展。Jin等[28]及其团队发现FEZF1-AS1在肺腺癌(lung adenocarcinoma, LAD)组织和细胞中高表达，且和肿瘤的大小、TNM分期、淋巴结转移及预后明显相关。细胞实验结果表明，干扰FEZF1-AS1的表达能够将LAD细胞阻滞在G1期，抑制肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡的发生。进一步实验发现，抑癌基因p57在LAD组织中显著低表达，沉默FEZF1-AS1能够明显地提高抑癌基因p57的表达水平；RIP及ChIP实验证实，FEZF1-AS1能够与EZH2和LSD1相结合，诱导它们结合到p57基因的启动子区域，使p57基因的启动子发生去甲基化，抑制p57基因的表达，导致细胞抑癌和抗癌基因表达的失衡，细胞发生恶性质变。此外，有研究指出沉默A549和SPC-A1细胞中的内源性FEZF1-AS1，FEZF1 mRNA及蛋白的表达水平都降低；利用si-RNA敲低FEZF1蛋白编码基因的表达，FEZF1-AS1的表达也受到明显抑制；统计学分析结果证实，FEZF1-AS1和FEZF1的表达呈明显正相关[29-30]。

5 FEZF1-AS1与其他肿瘤

5.1 FEZF1-AS1与骨肉瘤 Zhou等[31]发现FEZF1-AS1在骨肉瘤(osteosarcoma, OS)组织及细胞中高表达，且与OS分期分型、转移及预后显著相关。沉默FEZF1-AS1能够明显地减少U2OS和MG63S期细胞的数目，降低其增殖能力，同时能够抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移及减缓肿瘤在裸鼠体内的生长，显著地减小肺转移瘤的体积。生物信息预测及荧光素酶报告分析证实，miR-4443能和FEZF1-AS1直接结合，且FEZF1-AS1上只有一个miR-4443结合位点；过表达miR-4443能够抑制OS细胞中FEZF1-AS1的表达。进一步实验发现miR-4443能够与NUPR1 mRNA的3’-非翻译区域(untranslated region, UTR)相结合，且miR-4443过表达抑制了NUPR1 mRNA和蛋白质的表达，过表达FEZF1-AS1则能够上调肿瘤细胞中NUPR1 mRNA的水平。综上所述，FEZF1-AS1促进OS的发生发展，一部分是通过调节miR-4443/NUPR1轴实现的。

5.2 FEZF1-AS1与乳腺癌 乳腺癌已成为女性健康的一大杀手，近年来关于乳腺癌方面的分子机制研究也逐渐增多。研究发现FEZF1-AS1在乳腺癌组织和细胞中表达明显被上调，且FEZF1-AS1高表达患者的总体生存率更低，预后更差[32]。低表达FEZF1-AS1导致CD44+/CD24-乳腺癌干细胞样细胞(breast cancer-stem like cells, BCSC)及干细胞因子Nanog、OCT4及SOX2减少，降低了BCSC的成球能力，肿瘤细胞的干细胞能力被削弱。FEZF1-AS1主要位于胞质中，沉默FEZF1-AS1抑制了MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭以及肿瘤细胞在体内的生长。实验发现，miR-30a和FEZF1-AS1 3’-UTR之间有7个碱基互补配对，两者能直接结合，且miR-30a能够抑制FEZF1-AS1在肿瘤细胞中的表达。进一步研究发现，miR-30a和Nango mRNA的3’-UTR相结合，且能够FEZF1-AS1和Nango mRNA及蛋白的表达。即FEZF1-AS1能够通过对FEZF1-AS1/miR-30a/Nango轴的调节，影响乳腺癌的发生发展。从另一方面来说，对乳腺癌干细胞的研究也能为乳腺癌的治疗及预后评估带来巨大效益[33-34]。

5.3 FEZF1-AS1与多发性骨髓瘤 Li等[35]通过qRT-PCR测得FEZF1-AS1在多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)组织和细胞中高表达；干扰U266细胞中FEZF1-AS1的表达，能够阻止肿瘤细胞从G1到S期的转变，抑制肿瘤的增殖，增加U266细胞的凋亡。数据库分析发现，miR-610能够和FEZF1-AS1 3’-UTR结合，且miR-610与FEZF1-AS1的表达呈负相关。研究发现，用miR-610 mimics转染的U266细胞中Akt3(protein kinase B3)表达水平降低；在MM样本中，Akt3 mRNA的表达明显增加且与miR-610的表达呈负相关；沉默FEZF1-AS1能够减少Akt3 mRNA和蛋白的表达，FEZF1-AS1与Akt3的表达呈正相关。这表明FEZF1-AS1能够通过调节miR-610/Akt3轴促进MM细胞的增殖。

5.4 FEZF1-AS1与鼻咽癌 Cheng等[36]经过研究发现，FEZF1-AS1在鼻咽癌组织和细胞中较正常组织和细胞中明显高表达，且高表达的FEZF1-AS1与鼻咽癌的远端转移及患者较差的总体生存率、较低无的病生存率密切相关。敲低5-8F细胞中FEZF1-AS1的表达，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭受到显著抑制，p21表达被上调，cyclin D1表达被下调。此外，下调FEZF1-AS1的表达能够明显地抑制肿瘤在裸鼠体内的生长。进一步研究发现，干扰FEZF1-AS1的表达能够明显地促进E-cadherin的表达，抑制N-cadherin和Vimentin的表达从而抑制肿瘤细胞的EMT进程；同时也增加了β-catenin的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路。

6 小结及展望

FEZF1-AS1作为新发现的lncRNA，主要通过ceRNA或者招募PRC2的方式，调节肿瘤细胞内某些蛋白质的磷酸化以及染色质甲基化等表观遗传学修饰，调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞代谢，但FEZF1-AS1在其他方面的作用及机制仍需进一步研究。目前看来，FEZF1-AS1的研究仅限于肿瘤方面，并无在其他疾病中的报道。相信随着研究的逐步开展，上述谜团将被一一解开，FEZF1-AS1也可以在疾病尤其是恶性肿瘤的基因诊断、治疗以及预后评估等方面发挥重要的作用，更好地服务于临床实践。