自噬及其在肾纤维化中的作用研究进展

吴承，朱少明综述 程帆审校

肾纤维化(renal fibrosis)是由各种致病因素导致的肾脏结构进行性损坏和功能逐渐丧失的病理生理过程，是所有进展性慢性肾病(CKD)发展为终末期肾病的共同途径。其特征为细胞外基质(ECM)在肾小管间质中过度沉积。肾纤维化的发病机制是初始损伤后发生的一种失败或适应不良的肾脏修复过程，它涉及肾脏中几乎所有细胞类型的相互作用和协调[1]。肾纤维化是一个很难逆转的病理过程，目前尚无有效的治疗方法。自噬(autophagy)是细胞通过形成自噬体和自噬溶酶体对细胞质组分进行降解的过程。自噬除了具有分解代谢功能外，还是细胞对应激的一种适应性反应和保护机制，在各种疾病包括纤维化疾病的发病机制中发挥重要作用。近年来，多项研究证明自噬在肾纤维化疾病中起作用[2-3]，根据细胞或组织类型和病理状态，自噬可以促纤维化或抗纤维化[4-5]。这些研究表明诱导自噬可能参与肾纤维化的肾保护机制，但其相关调节机制尚未明确。因此，研究自噬及其在肾纤维化中的作用对于寻找肾纤维化的有效治疗靶点尤为必要。

1 自噬的概念及分类

自噬指细胞在各种应激条件下，通过形成双层膜结构的囊泡(即自噬体)，包裹细胞内损伤或变性的细胞器、蛋白质以及入侵的病原体等物质，并运送到溶酶体中进行降解的生物学过程。其过程大致分为诱导、核化、自噬前体的延伸、自噬体的成熟等4个阶段，它的典型特征是在细胞质中形成自噬体。自噬分为生理条件下的基础自噬以及应激条件下的诱导型自噬[6]。生理状态下，细胞通过自噬降解损伤、变性、衰老和失去功能的细胞、细胞器及各种生物大分子，实现细胞内物质的分解代谢和循环利用。病理状态下，自噬作为细胞的一种保护机制可以清除入侵的病原体，并可保护细胞免受毒性物质的损伤。根据功能和细胞内底物进入溶酶体的途径不同，又可将自噬分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)、分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)等3种主要类型[7]。巨自噬是研究最为广泛和深入的类型，通常所说的自噬即指巨自噬。微自噬是指直接通过溶酶体膜随机突出和内陷吞噬细胞内容物的一种非选择性降解过程。分子伴侣介导的自噬是由分子伴侣蛋白如热休克蛋白70(HSP70)识别含有特定序列五肽基的可溶性蛋白底物并与之结合，然后经过单独跨膜转移将这些底物运送到溶酶体内降解，但不能降解细胞器，此类型自噬只存在于哺乳动物细胞中，而且具有高度选择性。这3种类型的自噬虽然具有形态上的差异，但都达到了将内容物转运到溶酶体降解和循环利用的目的。

2 自噬过程中的分子机制

2.1 自噬的诱导 自噬的全过程受自噬基因(autophagy-related genes,ATGs)和自噬蛋白(autophagy-related proteins，Atgs)的高度调控。自噬蛋白在哺乳动物细胞中表示为ATGs，在酵母菌中表示为Atgs。细胞在内外某些不利因素如缺氧、饥饿、受损蛋白质蓄积、高温、细菌入侵等的诱导下，其平时处于抑制状态的自噬过程被启动[8]。目前发现有30多种自噬基因，其中与诱导自噬密切相关的是ULK1复合物(ULK1是ATG1在哺乳动物细胞中的同源蛋白)。ULK1复合物在正常状态下与雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)结合，当细胞受雷帕霉素作用或缺乏营养时，ULK1复合物与mTORC1解离而活化[9]，或当细胞处于其他应激状态时通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)被激活[10]。活化的ULK1使ATG13和FIP200磷酸化，形成ULK1/2-ATG13-FIP200复合物，将其他自噬蛋白转运到吞噬泡组装位点(phagophore assembly site, PAS)，并在此生成新月形的自噬前体膜[11]。

2.2 自噬前体的核化 继自噬蛋白之后，下一个被募集到PAS的是含有ATG14的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)。PI3K由PIK3C3/Vps34、PIK3R4/P150和Beclin-1组成，其主要通过与Beclin-1相互作用的蛋白质发挥调控作用，参与核化过程[12]。跨膜蛋白ATG9和液泡膜蛋白1(VMP1)在核化阶段发挥重要作用。研究表明，形成自噬前体膜所需的原料主要为线粒体、内质网、高尔基体的膜和质膜。ATG9在介导这些供体细胞器为自噬体前膜的形成供给原料过程中起关键作用[13]。VMP1则通过其ATG结构域与Beclin-1的BH3结构域相互作用，将PI3K募集至自噬前体膜[14]。同时，活化的ULK1使Beclin-1和ATG14L磷酸化来增强PI3K的活性[14]。PI3K将磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)磷酸化转变成磷脂酰肌醇三磷酸(PI3P)[15]，从而使自噬前体膜经过核化成为杯状结构的吞噬泡(phagophore)即自噬前体。

2.3 自噬前体的延伸 自噬前体的延伸需要2个泛素样(ubiquitin-like,UBL)蛋白系统的参与。第1个泛素样蛋白系统是ATG12。ATG12在E1激活酶ATG7和E2结合酶ATG10的作用下依次与ATG5和ATG16结合形成ATG12-ATG5-ATG16复合物[16]，该复合物与吞噬泡膜特异性结合，促进吞噬泡的延伸。第2个泛素样蛋白系统是LC3。ATG4将LC3前体切割成LC3-I，最初存在于细胞质中。随后LC3-I依次与ATG7和ATG3结合，并由这2种自噬蛋白加工处理，然后与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)耦联，形成脂质形式的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ结合于自噬体膜上，直至自噬体与溶酶体结合，是自噬体膜的特征性标志[17]。另外跨膜蛋白ATG9的转运能力和多聚化对自噬体的形成是必需的，在自噬前体膜的延伸过程中发挥重要作用[18]。

2.4 自噬体的成熟 自噬前体在延伸的过程中不断包裹胞浆中的受损蛋白质及异常细胞器，最终在边缘融合成为密闭的自噬体(autophagosome)，自噬体再与内涵体或溶酶体相互融合，成为自噬溶酶体(autolysosome)。该过程中，自噬体向溶酶体的转运依赖于微管，而自噬体与内涵体的融合需要VTI1B蛋白的参与[19]。紫外线抵抗相关基因(ultraviolet radiation resistance-associated gene,UVRAG)蛋白可以与PI3K复合物结合，并可以激活GTPase RAB7，GTPase RAB7可以促进自噬体与溶酶体的融合[20]。自噬溶酶体形成后，其中包裹的内容物被溶酶体水解酶降解，生成新的氨基酸、脂肪酸、核苷酸等小分子，供机体重新利用[11]。

3 自噬的调控

自噬是一个高度保守的过程，由许多不同的调节因子控制。在介导自噬的多条信号通路中，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Beclin-1、P53作为它们的交叉点，对自噬的调控起关键作用。mTOR是一种丝氨酸和苏氨酸激酶，由对雷帕霉素敏感的mTORC1和对雷帕霉素不敏感的mTORC2两种功能性多蛋白复合物组成，在调节细胞生长、蛋白合成、代谢和细胞死亡方面具有重要作用[21]。mTOR的上游是PI3K-Akt-mTORC1途径，其最显著的特征是调控细胞增殖[22]。Ⅰ型PI3K是一个信号传感器，它接收上游生长因子信号，并通过3-磷酸肌醇依赖性激酶1 (PDK1)促进Akt(蛋白激酶B)的磷酸化。Akt磷酸化后可激活mTORC1，并最终抑制自噬。mTOR的下游是ULK复合物，由Atg13 、ULK1/2和FIP200组成，这些组分都是启动自噬体形成所必需的[9]。在正常代谢条件下，mTORC1使Atg13磷酸化，阻止ULK1、ULK2和FIP200的结合，从而抑制自噬。在机体能量缺乏时，AMPK被激活，从而抑制mTORC1和激活ULK复合物，启动自噬体的形成[9-10]。ULK1复合物的调节信号对自噬的进展是至关重要的，这些信号启动Vps34与自噬启动子Beclin-1结合，形成Beclin-1复合物。Beclin-1复合物募集其他ATG蛋白定位于自噬前体膜，促进结合位点的形成和自噬蛋白的结合，并驱动自噬体形成的早期步骤。Beclin-1的功能可被不同的结合配体抑制或激活，例如被Bcl-2抑制和被UVRAG激活[23]。此外，肿瘤抑制蛋白P53在细胞发育中具有多种调节功能，包括诱导或抑制自噬。P53在自噬中的作用是位置依赖性的[24]，位于细胞核内的P53通过激活靶基因(如DRAM)诱导自噬，而位于细胞质中的P53则以细胞周期依赖性方式抑制自噬，但其抑制自噬的机制目前尚不完全清楚。

4 自噬与肾纤维化

肾纤维化是肾脏遭受内外多种致病因素的刺激，发生固有细胞损伤和大量胶原聚积，造成肾实质硬化和瘢痕形成，最终导致肾功能完全丧失的一种病理生理改变。其发生机制的主要特征是细胞外基质(ECM)的异常沉积[1]。在进行性肾脏疾病中，无论初始病因如何，肾纤维化是终末期肾病(ESRD)的共同途径。在体外和体内研究中已经表明，转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的上调在肾纤维化的发病机制中起重要作用，其中TGF-β1是其最丰富的同种型，已被确立为肾纤维化的中枢介质[2]。TGF-β1可通过Smad3依赖性或非依赖性机制诱导细胞外基质(如Ⅰ型胶原蛋白和纤维连接蛋白)的产生，也可通过抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和诱导MMP的天然抑制剂即金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)来抑制细胞外基质的降解[3]。最近研究表明，TGF-β1可调节自噬，而自噬可调节与肾纤维化相关的信号通路，如肾小管间质纤维化、肾小球硬化和糖尿病肾病[25-26]。在肾纤维化中，TGF-β1是一种具有双重功能的多效细胞因子，既能诱导胶原蛋白合成，又能诱导自噬和促进胶原蛋白的降解[2]。胶原蛋白合成和降解之间的平衡对于维持组织稳态至关重要。并且，TGF-β可以通过PI3K/Akt激活mTOR通路，因此它可能对自噬起激活和抑制的双重作用，这可能取决于特定的细胞类型和环境[3]。有研究表明，自噬的上调和下调都可能影响肾纤维化的转归和发展[4,27]。由此可见，自噬对肾纤维化的作用可能是多方面的和细胞特异性的。

5 自噬在肾纤维化中的作用

5.1 自噬抗肾纤维化的作用与机制 自噬可抑制肾纤维化，并且是维持肾脏和系膜细胞中细胞外基质稳态所必需的。目前已有的研究表明，自噬抑制肾纤维化的机制主要是通过促进活性TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)的降解[2]。TGF-β1是肾纤维化的有效诱导剂，可诱导细胞外基质的产生，包括胶原蛋白和纤维连接蛋白，其过度生产和逐渐积累是肾纤维化的标志。同时，TGF-β1也是自噬的重要诱导物，在体外培养的人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)中，TGF-β1诱导自噬体的积累和自噬蛋白LC3的转化，从而促进成熟TGF-β1的降解来抑制肾纤维化的进展[28]。并且，LC3介导的自噬可降解肾小管上皮细胞(RTEC)中的成熟TGF-β，从而减少TGF-β分泌并抑制由单侧输尿管梗阻(UUO)和肾损伤诱导的肾纤维化。此外，自噬蛋白Beclin-1亦有助于防止肾脏中胶原蛋白的过度沉积[28]。在肾纤维化的发展过程中，另一个重要因素是系膜细胞(MC)。在肾损伤和进展性肾病过程中，系膜细胞进行增殖并产生过多的细胞外基质，胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，Col-Ⅰ是与纤维化相关的主要类型。TGF-β1诱导的肾小球系膜细胞自噬，可通过降解细胞内Col-Ⅰ减少细胞外基质的产生和防止不溶性前胶原蛋白的过度积累[5]，从而抑制肾纤维化。另有研究发现，自噬还可保护肾小管细胞免受环孢霉素A(CsA)诱导的凋亡[29]，明显减轻肾功能障碍。除肾小管细胞外，肾损伤过程中诱导的自噬可保护系膜细胞免于凋亡，说明自噬不仅可保护上皮细胞，也可保护间充质细胞。此外，在自噬的调节因子中，mTOR抑制剂抗纤维化作用的相关研究表明，雷帕霉素抑制mTORC1信号通路对糖尿病肾病具有较强的肾脏保护作用[30-31]。但mTOR抑制剂抗纤维化作用的机制主要是由于其对自噬的间接诱导作用，还是由于其抗增殖活性，目前尚存在争议。

5.2 自噬促进肾纤维化的作用与机制 自噬不仅可以抑制肾纤维化，也能促进肾纤维化。例如，在UUO导致的肾纤维化小鼠模型研究中，持续激活肾小管细胞自噬促进肾纤维化[4]。自噬促进肾纤维化的机制主要是通过诱导肾小管萎缩和分解[32]。在肾纤维化中，自噬和肾小管萎缩的联系最初也是在单侧输尿管梗阻的动物研究中提出的。研究表明，自噬在阻塞的肾小管中被激活，表现为自噬体积聚、Beclin-1表达增加和LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化[4]。这些变化伴随着自噬溶酶体的增加和活性增强，进一步表明在阻塞的肾小管中诱导的自噬增强。伴随着自噬，在阻塞的肾小管中也诱导了肾小管细胞凋亡。重要的是，肾小管萎缩的发展与自噬和凋亡呈时间依赖性，提示自噬可能与细胞凋亡协同作用，诱导肾小管萎缩和肾单位丧失[4]。在类似研究中，Koesters等[33]通过在肾小管中过表达TGF-β1的四环素控制的转基因小鼠模型研究发现，TGF-β1的持续表达在肾小管细胞中诱导自噬，具有自噬特征的肾小管塌陷，细胞碎片填充残留腔。这些变化与广泛的肾小管周围纤维化有关。这种退化变性的细胞其细胞核显示正常染色，未见表示凋亡的TUNEL染色阳性。总之，这些结果表明自噬是TGF-β1诱导的肾纤维化中肾小管萎缩和分解的主要原因。除该机制外，另有研究表明，雷帕霉素激活自噬可诱导促纤维化信号传导级联效应[34]；而不受雷帕霉素直接影响的mTORC2/Rictor信号通路是TGF-β诱导的肌成纤维细胞活化的重要下游分支，该通路的激活高度促进肾纤维化的进展[35]。此外，通过TGF-β的正向前馈机制起作用的活性氧(ROS)是细胞应激中自噬的有效激活剂，其主要通过抑制mTOR介导的途径起作用[36]。这表明自噬可通过激活非Smad信号通路(包括ROS的产生)促进纤维化。但是，自噬在肾纤维化中的病理生理学影响仍需要进一步研究来阐明。

6 展望

自噬作为细胞在应激状态下的一种适应性反应和保护机制，在机体许多生物学过程中起重要作用。自噬的失调是导致多种疾病包括肾脏疾病的发病机制。已有研究表明，自噬失调与肾纤维化疾病密切相关，并支持自噬是一种细胞保护机制的观点。自噬是肾损伤中应激适应性反应不可缺少的机制，通过清除蛋白聚合物和受损细胞器，以及负向调节和防止肾脏中基质蛋白的过量积累，促进细胞存活和抗纤维化。但是，也有研究表明自噬促进肾纤维化。自噬在肾纤维化发病机制中的作用可能是多方面和复杂的。基于目前关于自噬在肾纤维化中的研究仍处于起步阶段，在未来的研究中，有必要进一步加深对自噬的机制和生理功能的认识，确定自噬是否可能成为预防或减轻肾纤维化发病机制的有效治疗靶点。