未免疫乳鸽嗉囊鸽乳和血清中新城疫病毒抗体的检测

◆作者：杜新府刘保国杭柏林,3陈文杰黄俊杰宁春妹

◆单位：1.河南省叶县畜牧局；2.河南科技学院动物科学学院；3.教育部禽类预防医学重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室扬州大学兽医学院

新城疫（Newcastle disease）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的鸽的一种重要的病毒性传染病，对养鸽业危害甚大。常常使用疫苗来预防鸽新城疫的发生。种鸽免疫后，新城疫抗体可通过卵黄进入乳鸽体内，成为母源抗体。了解雏鸡血清中新城疫病毒母源抗体的变化有利于帮助确定新城疫病毒疫苗的初次免疫时间，而这一原理也同样适用于乳鸽。鸽乳（Pigeon milk）是哺育期亲鸽嗉囊分泌的用来喂养乳鸽的营养液，主要成分是蛋白质和脂肪，包括IgG、IgA和IgY等免疫球蛋白，对乳鸽的生长发育具有重要作用。但是，目前尚不清楚新城疫病毒疫苗免疫亲鸽分泌的鸽乳进入乳鸽嗉囊后是否还有新城疫病毒的抗体。因此，本研究主要检测了新城疫病毒疫苗免疫亲鸽所哺育乳鸽血清和嗉囊鸽乳中的新城疫病毒抗体，分析了其变化规律及其相关性，以期为生产实践提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验鸽

试验用乳鸽来自河南淇县某鸽场，出壳后没有用任何疫苗免疫。亲鸽在配对前用新城疫病毒（Ulster 2C株）灭活苗进行饮水免疫，自由采食、饮水，采用“2+4”的方式哺育乳鸽。

1.2 试剂与仪器

新城疫病毒（La Sota株）弱毒疫苗购自哈药集团生物疫苗有限公司，新城疫病毒(Ulster 2C株)灭活苗购自南京梅里亚动物保健有限公司。氯化钠购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司，碘酊购自德州欣瑞达消毒制品有限公司，医用酒精购自洛阳市洁康消毒剂厂，氯仿购自洛阳昊华化学试剂有限公司，柠檬酸钠购自天津市北辰方正试剂厂，其它为实验室常规试剂。

离心机（型号为80-2）购自上海手术器械厂，高压灭菌器（型号为LDZX-30KAS）购自上海申安医疗器械厂，移液器（型号为Reserch plus）购自德国Eppendorf股份有限公司，生化培养箱（型号为GNP-9270）购自上海精宏实验设备有限公司，天平（型号为HC-C）购自慈溪市华徐衡器实业有限公司，冰箱（型号为 BCD-610W(KA92NV02TI)）购自波西化电器(安徽)有限公司。

1.3 鸽血清和鸽乳的采集

用一次性注射器从乳鸽的心脏中采集血液，4000 r/min离心 10min，收集血清，4℃保存，待测，1日龄17份样品，5日龄10日龄各10份样品。将乳鸽嗉囊部用碘酊、酒精消毒，用无菌剪刀剪开嗉囊，用一次性注射器吸取鸽乳，1日龄、5日龄和10日龄各10份样品。

1.4 鸽乳中抗体的提取

鸽乳中抗体的提取按照文献的方法进行。取1mL鸽乳与1mL生理盐水，充分震荡混合1min，然后加入2mL氯仿，充分震荡混合2min，室温中静置1h，4000 转 /分钟离心 10min，收集上清，4℃保存，待测。

1.5 1%鸡红细胞的制备

健康公鸡血液（3.8%柠檬酸钠抗凝）采集自新乡市洪门镇菜市场。按照文献（杭柏林等，2017）的方法制备1%鸡红细胞悬液，4℃保存，备用。

1.6 血凝和血凝抑制试验

血凝和血凝抑制试验采用微量法进行，具体操作按照文献（杭柏林等，2017）的方法进行。

1.7 统计分析

用GraphPad Prism软件进行绘图，并进行t-test和相关性分析（two-tailed，95%confidence）检验。

2 结果与分析

2.1 未免疫乳鸽血清中新城疫病毒抗体检测结果

未免疫乳鸽血清中新城疫病毒抗体的检测结果如图1所示。从图1中可以看出，随着日龄的增加，抗体水平呈逐渐下降的趋势，但差异不显著（P＞0.05）。这表明，未免疫乳鸽从出壳开始，血清中的新城疫病毒抗体逐渐下降，但下降趋势较缓。

图1 鸽血清中新城疫抗体检测结果

2.2 未免疫乳鸽嗉囊鸽乳中新城疫病毒抗体检测结果

未免疫乳鸽鸽乳中新城疫病毒抗体的检测结果如图2所示。从图2中可以看出，随着日龄的增加，鸽乳中新城疫病毒抗体呈显著性下降（P＜0.05），第 5日龄时绝大数检测鸽的鸽乳已经没有新城疫病毒的抗体，第10日龄时所有检测鸽的鸽乳中已经没有新城疫病毒抗体了。这表明鸽乳中新城疫病毒抗体水平随日龄增加下降极快。

图2 鸽乳中新城疫抗体检测结果

2.3 血清和嗉囊鸽乳中新城疫病毒抗体的相关性

经分析，1日龄、5日龄和10日龄时血清和嗉囊鸽乳中新城疫病毒抗体水平没有相关性（P＞0.05）。

3 讨论

乳鸽出壳后体内新城疫病毒母源抗体水平高低影响到机体对新城疫病毒的抵抗力。姚月华等（2005）认为，新城疫病毒疫苗免疫次数少的种鸽血清中含有的新城疫病毒血凝抑制（HI）抗体水平低，所产乳鸽血清中含有的新城疫病毒母源HI抗体水平就更低，常不足以提供保护，使得乳鸽易发生新城疫。在本研究中，1日龄乳鸽血清中新城疫病毒HI抗体平均水平(5.059 log2)高于4log2，但5日龄时乳鸽血清中新城疫病毒HI抗体平均水平(4.2 log2)非常接近于4log2，到10日龄时乳鸽血清中新城疫病毒HI抗体平均水平 (3.8 log2)已经低于4log2。因此，推荐该鸽场的乳鸽应在3-5日龄时进行新城疫病毒疫苗的免疫。

亲鸽所产生抗体可通过卵黄传递给子代。Ahmad等（2013）用钥孔戚血蓝素（KLH）免疫母鸽，在子代鸽血清中检测到了抗KLH的抗体，并随着日龄增加，抗体水平逐渐下降，但认为亲鸽嗉囊鸽乳中不含有抗体或不含有能通过胃屏障到达血流的抗体，因其测定的抗体类型是IgY，不是IgA。有研究认为，在鸽乳中检测不到抗KLH的IgY。鸽乳中的IgA在乳鸽胃部有重要的保护作用，并能部分到达血流。但嗉囊鸽乳中的抗体不影响乳鸽血清中抗体的消长规律。在本研究中，各日龄时血清和嗉囊鸽乳中新城疫病毒的HI抗体之间没有相关性。这表明，嗉囊鸽乳中的抗体对血清中的抗体水平没有影响。然而，1日龄时绝大多数鸽嗉囊鸽乳中检测到新城疫病毒血凝抑制（HI）抗体，5日龄时仅个别鸽嗉囊鸽乳中检测到新城疫病毒（HI）抗体，而到10日龄时鸽嗉囊鸽乳中检测不到HI抗体。抗体逐渐降低或检测不到的可能原因是，随着日龄增加，亲鸽鸽乳中新城疫病毒HI抗体的分泌量逐渐减少，或者是乳鸽嗉囊中的微生物的种类和数量越来越多，将新城疫病毒HI抗体降解了。但究竟是何原因，还需要深入探讨。

4 小结

随日龄增加，未免疫乳鸽血清中新城疫抗体水平下降速度较缓，而嗉囊鸽乳中新城疫抗体水平极具下降，血清和嗉囊鸽乳中的新城疫抗体水平没有相关性。