异丙肾上腺素对大鼠牙移动过程中牙槽骨微结构的影响

罗金莉，杜希希，袁小平

正畸牙移动过程中，成骨和破骨的活动可以通过交感神经系统调节，在破骨细胞及成骨细胞的表面都有肾上腺素能受体存在，β2-肾上腺素受体(β2-adrenergicreceptor，ADRB2)可通过交感神经系统的支配对骨进行负向调节。核因子-κB 激活受体配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)是目前所知的能够直接刺激促进前体破骨细胞分化成熟和激活成熟的破骨细胞的细胞因子[1]。Mirco-CT是用来研究动物骨小梁结构改变的有力辅助工具[2]。牙槽骨中骨体积分数(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁分离度(trabecular spcing，Tb.Sp)、骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)等指标的测定被一些学者用来了解某些药物对正畸过程中骨改建的作用[3]。本研究旨在利用Micro-CT以及检测ADRB2、RANKL的表达量来研究异丙肾上腺素对大鼠牙移动过程中牙槽骨微结构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康的8周龄SPF级SD雌性大鼠50只，由西南医科大学动物实验中心提供，体质量200～250 g，分笼饲养，每笼5只，保持室温25 ℃，自由饮水及饮食。

1.2 仪器与材料PET/CT(西门子Inveon micro-PET/CT)；盐酸ISO(上海麦克林生化科技有限公司)；兔抗鼠ADRB2抗体(上海艾博抗贸易有限公司)，兔抗鼠RANKL 抗体(北京索莱宝科技有限公司)；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase，SP)超敏试剂盒、酶底物显色剂DAB(福州迈新生物技术公司)。

1.3 方法

1.3.1实验分组以及大鼠牙移动模型的建立 随机数字表法将实验大鼠分为ISO组和对照组，每组25只。以 10%水合氯醛(0.04 ml/g)腹腔注射对大鼠进行全身麻醉，以大鼠两颗切牙为支抗牙，在大鼠切牙唇侧及近远中备一条连续的固位沟，用0.2 mm的结扎丝经右上第一磨牙与第二磨牙之间的牙间隙穿过，将一螺旋拉簧(直径0.01 mm，长度6 mm)结扎于上颌的两切牙固位沟内和右上第一磨牙之间，由正畸测力计测得50 g力值牵引右上第一磨牙。使用粘结树脂将结扎丝固定于固位沟上，每天检查装置脱落情况，每7 d加力1次。正畸牙移动模型建立好后即刻对ISO组腹腔注射ISO[1 mg/(kg·d)]，对照组腹腔注射等体积生理盐水，给药和加力同步开始，每晚定时给药。

1.3.2Micro-CT观察异丙肾上腺素作用下大鼠牙齿移动过程中骨微结构的变化 第14天腹腔注射过量50%水合氯醛处死两组大鼠各5只，取上颌骨，4%多聚甲醛中固定，采用西门子 Inveon micro-PET/CT对处理后的标本进行扫描，扫描范围为右侧上颌第一磨牙、第二磨牙、第三磨牙及周围牙槽骨组织。用三维测量软件对扫描后的图像进行处理，在Micro-CT 扫描图像中，选择右侧上颌第一磨牙近中根与远中根间牙槽间隔的牙槽骨为目标区域(图1)。使用 Inveon micro-PET/CT自带软件对选定区域进行三维重建，并对该部分的骨小梁结构参数进行测量。主要测量参数：骨体积分数(BV/TV)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁数目(Tb.N)。

图1 目标区域Micro-CT扫描图像 ×0.68 A：矢状面；B：水平面；C：垂直面

1.3.3SP法检测ADRB2及RANKL在大鼠压力侧牙周组织中的表达 在第0(未给药)、7、14、21天腹腔注射过量50%水合氯醛处死两组大鼠各5只，取上颌颌骨，完整剪下右侧第一磨牙及周围的牙槽骨，立即放入4%多聚甲醛中固定，24 h后放入EDTA脱钙液中常规脱钙3个月。脱钙完成后，经过各级乙醇溶液脱水。然后置于二甲苯中透明，石蜡包埋。沿牙体长轴进行切片，获得数张近远中向连续切片，每张切片厚度大约为3 μm。在各个时间点ISO组、对照组中随机选择第一磨牙压力侧牙周组织完整的切片各5张，严格依照SP试剂盒说明对大鼠第一磨牙及其周围牙槽骨标本进行ADRB2以及RANKL免疫组化染色后，将切片置于OLYMPUS正置相差显微镜下观察染色情况；再将切片放于自来水下冲洗，苏木精复染，PBS溶液冲洗返蓝；常规脱水、透明、封片。将切片放入OLYMPUS正置相差显微镜观察，分别在ISO组、对照组的每张染色切片上确定一个部位，即大鼠右侧上颌的第一磨牙压力侧牙周膜近牙槽骨区域；在压力侧牙周组织中从牙槽嵴顶到牙根尖部随机各选取5个目标视野并拍照。采用Image Pro Plus6图像分析软件包测量图像的平均光密度(mean optical density，MOD)。检测各组标本中ADRB2、RANKL的MOD值。

2 结果

2.1 Micro-CT观察骨微结构的变化给药后第14天，ISO组大鼠BV/TV小于对照组，Tb.Sp大于对照组，Tb.N小于对照组，差异有统计学意义(F=38.58，F=24.73，F=18.71，P<0.05)。见表1。

表1 牙槽骨微结构

与对照组比较：*P<0.05

2.2 SP法检测ADRB2的表达两组大鼠牙齿及牙周组织中均存在ADRB2阳性表达，ADRB2阳性表现为棕黄色的细胞质与细胞膜，其棕黄色颜色越多表明ADRB2的阳性表达越强。在第0(未给药)、7、14、21天各组ADRB2的MOD值均呈上升趋势。给药后第7、14、21天，ISO组的ADRB2的MOD值均高于对照组(F=20.19,F=14.16,F=6.94,P<0.05)，见表2、图2、3。

表2 ADRB2的MOD值

与对照组比较：*P<0.05

2.3 SP法检测RANKL的表达两组大鼠牙齿及牙周组织中均存在 RANKL ，视野中棕黄色为阳性表达。在第0(未给药)、7、14、21天，对照组大鼠第一磨牙压力侧牙周组织中RANKL平均光密度值一直呈增长趋势，ISO组在给药后第7、14天上升，而第14、21天下降，第14天达到最高峰。给药后第7、14天，ISO组均高于对照组(P<0.05,F=5.37、8.89),给药后第21天，ISO组高于对照组(P>0.05,F=3.55)，见表3、图4、5。

图2 ISO组ADRB2阳性表达 ×200 A：第0天；B：第7天；C：第14天；D：第21天

图3 对照组ADRB2阳性表达 ×200 A：第0天；B：第7天；C：第14天；D：第21天

表3 RANKL平均光密度值

与对照组比较：*P<0.05

图4 ISO组RANKL阳性表达 ×200 A：第0天；B：第7天；C：第14天；D：第21天

图5 对照组RANKL阳性表达 ×200 A：第0天；B：第7天；C：第14天；D：第21天

3 讨论

在牙槽骨的改建中破骨细胞发挥了重要的作用，活化成熟的破骨细胞和新生破骨细胞的诱导成熟是破骨细胞进行骨吸收的重要前提[4]。在骨改建的各种研究中，破骨细胞的分化与激活一直是研究的重点，破骨细胞的分化和功能发挥受到 OPG/ RANKL/ RANK系统的调节，还受到自主神经系统的调节。实验研究中大鼠牙移动压力侧RANKL表达量增加，说明异丙肾上腺素促进大鼠牙移动压力侧的破骨活动。

王承勇 等[5]使用外科手术的方法建立了失去交感神经支配的大鼠模型，发现其能有效地抑制颌骨骨吸收，从而证明了交感神经系统确实参加了对颌骨骨代谢的调控。国内外大量的研究[6-9]表明交感神经系统参与骨代谢的调节。实验研究中大鼠牙移动压力侧ADRB2表达量增加，说明异丙肾上腺素促进大鼠牙移动压力侧交感活性，从而推测ISO可能通过ADRB2刺激破骨细胞的生成。

Micro-CT技术用于骨组织骨微结构的研究，较以往采用的骨形态计量方法，Micro-CT测量出的骨小梁各参数更加精确。Micro-CT成像已被证实与大鼠和人体样本的骨组织形态计量学分析密切相关[10-11]。采用Micro-CT观察不同浓度异丙肾上腺素作用下大鼠牙齿移动过程中微观结构，能够更加准确地得到牙槽骨骨体积分数、骨小梁分离度以及骨小梁数目等结构参数。