pEGFP-N1-IL-17通过调控Fas/FasL信号通路影响喉癌Hep-2细胞的凋亡

张红健，宋 杨，杨 明，季加标，杨见明

头颈部有一种发病率较高的肿瘤，以鳞状细胞癌为主，就是喉癌[1]。喉癌在临床治疗上主要以手术或者手术联合放化疗方式，会不同程度地影响患者的喉功能和生活质量都会大大下降。所以必须研究更多的像免疫治疗这类的方法来治疗喉癌[2]。白介素-17(IL-17)是CD4+T Th17等细胞分泌的一种细胞因子[3]。IL-17的相关研究主要集中在肿瘤疾病方面[4]。还有研究[5]显示Lewis肺癌荷瘤小鼠的MDSCs细胞的凋亡也是可以被IL-17抑制的。也有研究[6]表明Fas 又称 Apo-1 或 CD95 分子，属于肿瘤坏死因子受体家族类，为 Fas 配体( FasL)的受体，Fas与FasL的结合，促进细胞凋亡[7]。有相关研究[8-9]显示喉癌组织中Fas和FasL的表达是下降的，说明存在某些细胞因子阻断Fas介导的凋亡途径。研究[6]表明，IL-17可以通过IL-6/IL-6R/JAK1/STAT3通路来调控Hep-2细胞的侵袭和转移。

1 材料与方法

1.1 细胞培养喉癌细胞(Hep-2细胞)购自南京凯基生物科技发展有限公司。细胞培养基(DMEM+青霉素+链霉素+10%胎牛血清)，用5%的CO2细胞培养箱在37 ℃条件下培养。Opti-MEM(×1)和Lipofectamine 2000均购于美国Life Technology公司。

1.2 试剂Opti-MEM培养基、TRIzol Reagent购于美国Invitrogen公司；血清购自美国Hyclone公司；总RNA提取试剂盒购于德国Qiagen公司。pEGFP-N1-IL-17购于武汉金凯瑞生物工程有限公司；胎牛血清购于浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM培养液购于美国HyClone公司；抗PI3K单克隆抗体和抗p-PI3K抗体均购于美国Abcam公司。抗FasL抗体和抗Fas抗体均购于美国CST公司；Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8抗体均购于美国Immunoway公司；抗β-actin 抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司；山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均购于美国ABclonal公司;Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于美国BD公司；蛋白 Marker、ECL荧光剂(显影剂)胰酶、5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、一抗稀释液、二抗稀释液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA法蛋白浓度检测试剂盒均购于上海碧云天生物有限公司；逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix购自北京TaKaRa Clontech公司；扩增引物购自上海生工生物工程股份有限公司；荧光染料Maxima SYBR Green/ROX qPCR购自美国Thermo公司。

1.3 仪器超净工作台(型号：SW-9800)购于苏州泰安空气技术有限公司。恒温细胞培养箱(型号：NAPCO-8800)购于美国SHELLAB公司；CytoFLEX流式细胞仪(Tanon)购自美国BECKMAN COULTER公司；Western blot 电泳仪购于上海天能科技有限公司；逆转录反应仪器购自美国ABI公司；Mastercycle epgradient Eppendorf PCR 扩增仪购自德国Eppendorf公司。

1.4 qRT-PCR法检测重组质粒IL-17(pEGFP-N1-IL-17)转染喉癌Hep-2细胞后IL-17的表达收集转染的细胞加1 ml TRIzol试剂，提取总RNA。(提取六孔板每个孔中RNA，加水配到8 μl)：在37 ℃温度条件下进行逆转录反应15 min。每组有3个复孔。反应条件：95 ℃、20 s预变性，循环内95 ℃、10 s变性，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共设置40个循环，然后设置(95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s)反应步骤。扩增完成之后采用ΔCt法分析定量结果。

1.5 IL-17过表达重组质粒的构建与鉴定结构序列设计合成2对引物：第1对引物位于IL-17cDNA的起始密码和终止密码前后端，两侧分别含AgeI酶切位点，用于PCR钓取扩增目的基因：正义链5′-CGCTGATGGGAACGTGGACTAC-3′和反义链5′-GGTGGACAATCGGGGTGACA-3′。第2对引物根据目的基因及载体本身序列设计，用于鉴定IL-17定向连接的阳性克隆菌落以及测序，通过PCR扩增获得目的基因IL-17cDNA片段，纯化后经Age I酶切消化。用Age I酶酶切载体质粒、回收线性载体片段。用T4噬菌体DNA连接酶将IL-17线性化载体连接，再转化、涂板、挑取克隆、扩增，试剂盒提取质粒，酶切，最后用PCR凝胶电泳鉴定，再测定序列。通过运用PCR法，从质粒中将人IL-17cDNA扩增，并将其成功插入pEGFP-N1载体中，经过测序和验证之后，pEGFP-N1-IL-17载体成功构建。把质粒pEGFP-N1和PCR产物进行双酶切(BamH I和EcoR I)，再用T4连接酶连接酶切产物，过夜后转入感受态细胞E.coliDH5a中进行扩增，挑取克隆提质粒行双酶切鉴定并选择纯化pEGFP-N1-IL-17重组质粒，在北京华基因生物工程公司进行测序。

1.6 重组质粒pEGFP-N1-IL-17转染喉癌Hep-2细胞把培养瓶中的喉癌Hep-2细胞用不含EDTA的胰酶消化，消化后把相同数量的细胞接种到6孔板中，铺匀，使其在转染日的细胞密度能达到90%，6孔板中的每个孔中加入2 ml培养液(DMEM配的培养基用于Hep-2细胞)，在37 ℃细胞培养箱中培养6孔板。细胞长到贴壁状态以后，弃培养液，PBS洗2次。每孔加入1 500 μl Opti-MEM (注意用无酶枪头)。加药时注意用无酶枪头、避光，设置6孔板的3个孔分别为空白对照组、阴性对照组和实验组。先将空白对照组、阴性对照组和实验组的3个孔的药加好：取6个无酶EP管，分成3组：空白对照组、阴性对照组和实验组。空白对照组的2个无酶EP管每管加入250 μl Opti-MEM，再在其中一管中加入Lipofectamine 2000 5 μl，混匀，另一管不加；阴性对照组的2个无酶EP管，一管加Lipofectamine 2000 5 μl混匀，另一管加10 μl pEGFP-N1-NC，混匀；实验组的2管其中一管加5 μl Lipofectamine 2000充分混匀，另一管加10 μl pEGFP-N1-17，充分混匀，避光静置5 min后将每组的两管药混匀，再避光20 min，然后将这3组药分别加入空白对照组、阴性对照组、实验组的板孔中(已经用PBS洗2次，每孔加入1 500 μl Opti-MEM的6孔板中)。在各组的药加好之后，把6孔板置于37 ℃细胞培养箱中培养6 h，到时间后用PBS洗2次，再换上细胞培养基(DMEM +10%胎牛血清用于Hep-2细胞)，每孔加2 ml，培养24 h。

1.7 Western blot法检测重组质粒pEGFP-N1-IL-17转染喉癌Hep-2细胞后IL-17的表达用Western blot法分别检测空白对照组、阴性对照组、实验组中IL-17的表达情况。制备Hep-2细胞悬液，以相同的数量接种到6孔板中，培养6 h，弃去培养基，清洗细胞，空白对照组中加入培养基，阴性对照组加入pEGFP-N1-NC，实验组加入pEGFP-N1-IL-17处理6 h，弃去培养液，用PBS洗2次，再换上细胞培养基，每孔加2 ml，培养24 h。弃去培养液，4 ℃预冷，PBS清洗细胞，培养板中加入蛋白裂解液(含PMSF及磷酸化酶抑制剂)充分裂解细胞，13 000 r/min，4 ℃，离心20 min，吸取上清液；BCA试剂盒检测蛋白浓度后分装保存。加入5×loading buffer(比例为4 ∶1)和相应体积的总蛋白样品，在干浴锅中煮蛋白液使其变性，保存在-20 ℃冰箱中。每个泳道加20 μg蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳；分离凝胶中的蛋白要转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶孵育PVDF膜2 h。TBST洗涤，洗涤3次，每次10 min。抗IL-17抗体孵育过夜。再用TBST洗涤3次，每次10 min。二抗孵育膜1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，用ECL化学发光底物显影检测蛋白。最后用Image-Pro plus 图像处理系统分析并计算Western blot灰度值。

1.8 Western blot法检测重组质粒pEGFP-N1-IL-17对喉癌Hep-2细胞中Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表达的影响用Western blot法分别检测空白对照组、阴性对照组、实验组中的Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白的表达情况。制备Hep-2细胞悬液，以相同的数量接种到6孔板中，培养6 h。弃去培养基，清洗细胞，空白对照组加入培养基，阴性对照组加入pEGFP-N1-NC，实验组加入阳性pEGFP-N1-IL-17处理6 h后用PBS洗2 次，再换上细胞培养基，每孔加2 ml，培养24 h，弃去培养基，PBS清洗细胞，在培养板中加入蛋白裂解液裂解细胞，13 200 r/min、4 ℃离心20 min，提取上清液分装保存。加入5×loading buffer(比例为4 ∶1)和相应体积的总蛋白样品，在干浴锅中煮蛋白液使其变性，保存在-20 ℃ 冰箱中。每个泳道加20 μg蛋白电泳；转移蛋白到PVDF膜上。5%脱脂牛奶孵育PVDF膜2 h。TBST洗涤3次，每次10 min。用Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8、β-actin 抗体孵育过夜。再用TBST洗涤3次，每次10 min，再用TBST洗涤3次，每次10 min。二抗孵育膜1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，显影，分析 Western blot 灰度值。

1.9 流式细胞仪检测重组质粒pEGFP-N1-IL-17对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响将喉癌Hep-2细胞消化，接种到6孔板中相同的量(每孔细胞计数为1×106)，等细胞长至贴壁状态以后，倒掉培养液，PBS洗2次，空白对照组加入培养基，阴性对照组加入pEGFP-N1-IL-NC，实验组加入pEGFP-N1-IL-17处理6 h后用PBS洗2次，再换上细胞培养基，每孔加2 ml，培养24 h，用不含EDTA的胰酶消化细胞，用15 ml离心管收集，300 r/min、4 ℃离心5 min，弃去上清液，400 μl PBS洗涤2次，用PE-7AAD染料对Annexin V-FITC/PI染色。用流式细胞仪检测，最后分析实验结果。

2 结果

2.1 qRT-PCR、Western blot法检测重组质粒IL-17表达情况将双酶切和测序结果均正确的质粒转染后的Hep-2细胞，转染重组质粒IL-17的喉癌Hep-2细胞作为实验组，转染pEGFP-N1-NC空载体的喉癌Hep-2细胞作为对照组，48 h后收集细胞并分为2份：1份提取RNA，通过qRT-PCR在mRNA水平检测细胞IL-17表达水平；另一份提取蛋白，通过Western blot在蛋白水平检测细胞IL-17表达水平。结果均表明重组质粒IL-17在喉癌Hep-2细胞能够成功表达，见图1。

图1 qRT-PCR、Western blot法检测重组质粒 IL-17转染喉癌Hep-2细胞后IL-17的表达情况

A： qRT-PCR检测结果；B：Western blot法检测结果；Control：空白对照组；Scramble：阴性对照组；pEGFP-N1-IL-17：实验组；与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.2 重组质粒pEGFP-N1-IL-17对喉癌Hep-2细胞中Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表达的影响与空白对照组相比，阴性对照组细胞内的Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白的表达无明显变化(F=58.170，P=0.218)。与空白对照组比较，实验组4种蛋白明显降低，差异有统计学意义(F=72.15，P<0.01)。见图2。

图2 Western blot 法检测重组质粒 pEGFP-N1-IL-17转染喉癌Hep-2细胞中Fas、FasL、 Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表达的变化

与空白对照组(Control)比较：*P<0.05，**P<0.01

2.3 重组质粒(pEGFP-N1-IL-17)对Hep-2细胞凋亡的影响空白组凋亡率为(11.4±1.52)%，阴性对照组凋亡率为(12.64±7.28)%，实验组凋亡率为(3.39±5.37)%，实验组与空白对照组和阴性对照组比较，实验组的凋亡率明显降低(F=58.48，P<0.01)。见图3。

3 讨论

喉癌是以鳞状细胞癌为主的头颈部常见的恶性肿瘤[1]。对喉癌患者来说，非手术疗法可以保留喉的正常解剖结构和喉的生理功能，这种治疗方法对喉癌患者具有很大的意义[2]。IL-17是CD4+T Th17 等细胞分泌的一种细胞因子[3]。IL-17的相关研究主要集中在肿瘤疾病方面[4]。还有研究[5]显示Lewis肺癌荷瘤小鼠的MDSCs细胞的凋亡也是可以被IL-17抑制的。细胞凋亡是由多基因调控的，主要有两条途径来调控：一是细胞膜上的受体途径，二是细胞内的线粒体途径[10]。细胞膜上的受体途径中Fas与Fasl结合可触发凋亡，细胞凋亡有一条主要途径是由Fas、FasL介导的，此通路的某些环节缺失可能与肿瘤细胞的无限增殖有关。Fas作为一种细胞表面受体，与其配体FasL结合后，使细胞表面形成胞内衔接子三聚体，导致 caspase1、3、6、7形成级联反应诱导细胞的凋亡[11]。本实验Western blot研究结果表明：用pEGFP-N1-IL-17转染24 h后的喉癌Hep-2细胞内 Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。同时Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测的结果表明：与空白对照组比较，用pEGFP-N1-IL-17转染24 h后的喉癌Hep-2细胞的凋亡率明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

本研究结果表明，重组质粒pEGFP-N1-IL-17转染后的喉癌Hep-2细胞Fas及其配体FasL明显下调，同时Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8表达也明显下调，提示重组质粒pEGFP-N1-IL-17可能通过下调 Fas和FasL蛋白表达，抑制caspase 8后阻断caspase3的活化，从而抑制喉癌细胞Hep-2凋亡。所以IL-17可能通过Fas/FasL信号通路来抑制喉癌Hep-2细胞凋亡，为研究喉癌的机制和治疗喉癌提供了依据。除Fas/Fasl介导的死亡受体途径，IL-17是否可以通过其他途径抑制喉癌Hep-2细胞凋亡仍需探索。

图3 流式细胞术检测重组质粒(pEGFP-N1-IL-17)对Hep-2细胞凋亡的影响A：空白组；B：pEGFP-N1-NC组；C：pEGFP-N1-IL-17组