γ-干扰素释放试验在结核病诊断中的应用

董玉兰 谢超 徐冉

摘要：目的  探討γ-干扰素释放试验（IGRAs）在结核病诊断中的应用价值。方法  选取2017年7月～2019年6月在景德镇市第一人民医院就诊的100例疑似结核感染患者和50例健康体检者作为研究对象，分别行γ-干扰素释放试验和涂片抗酸染色镜检。将最终确诊为结核病患者48例设为结核病组，52例非结核病患者作为非结核病组，50例健康体检者设为正常对照组。分析三组TB-IGRAs阳性率，对比肺结核病组涂阴与涂阳TB-IGRAs检测结果，并比较TB-IGRAs与涂片抗酸染色对结核病的诊断效能。结果  结核病组IGRAs阳性率高于非结核病组和正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;涂阳肺结核和涂阴肺结核患者的IGRAs阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）;IGRAs法敏感度为85.42%，特异性为89.22%，阳性预测值为78.85%，阴性预测值为92.86%;涂片抗酸染色法敏感度为22.92%，特异性为100.00%，阳性预测值为100.00%，阴性预测值为73.38%; IGRAs诊断结核病的敏感度高于涂片抗酸染色，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  IGRAs具有较高的敏感度和阴性预测值，对结核病的诊断具有较高的诊断价值，值得在临床中应用。

关键词：γ-干扰素释放试验;结核病;涂片抗酸染色

中图分类号：R446.6;R378.91                           文献标识码：A                           DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.21.021

文章编号：1006-1959（2019）21-0066-03

Abstract：Objective  To investigate the value of Interferon-Gamma Release Assays （IGRAs） in the diagnosis of tuberculosis. Methods  A total of 100 suspected tuberculosis patients and 50 healthy subjects from the First People's Hospital of Jingdezhen City from July 2017 to June 2019 were enrolled as Interferon-Gamma Release Assays and smear acid-fast staining. Microscopic examination. Forty-eight patients with tuberculosis were diagnosed as tuberculosis， 52 patients with non-tuberculosis as non-tuberculosis group， and 50 healthy subjects were set as normal control group. The positive rates of three groups of TB-IGRAs were analyzed. The results of TB-IGRAs test of smear and smear were compared with tuberculosis group， and the diagnostic efficacy of TB-IGRAs and smear acid-fast staining for tuberculosis was compared. Results  The positive rate of IGRAs in the tuberculosis group was higher than that in the non-tuberculosis group and the normal control group，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the positive rate of IGRAs between smear-positive pulmonary tuberculosis and smear-negative tuberculosis （P>0.05）. The sensitivity of IGRAs method was 85.42%， and the specificity was 89.22%. The predicted value is 78.85%， the negative predictive value is 92.86%; the sensitivity of smear acid-fast staining is 22.92%， the specificity is 100.00%， the positive predictive value is 100.00%， and the negative predictive value is 73.38%; IGRAs is sensitive to the diagnosis of tuberculosis The degree was higher than the smear-resistant acid staining，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  IGRAs have high sensitivity and negative predictive value， and have high diagnostic value for the diagnosis of tuberculosis. It is worthy of clinical application.

Key words：Interferon-Gamma Release Assays;Tuberculosis;Smear acid-fast staining

结核病（tuberculosis）属于一种由结核分枝杆菌（M. tuberculosis，MTB）引起的慢性传染性疾病，由于人口密度的上升，致使该病在人群中的发病率极高，严重威胁了人类健康[1]。据2010年我国第五次结核病流行病学抽样调查估计，结核病年发病例100万，发病率78/10万。通过加强结核病防治工作和落实结核病控制措施，近十余年来我国的结核病疫情呈下降趋势，但我国原结核病疫情比较严重，各地区差异大，结核病防控工作任重而道远[2]。如何快速发现患者的症状变化及准确诊断结核杆菌感染情况是提高结核病治愈率的关键。既往临床上多采用微生物监测（细菌痰培养、痰涂片）、影像学监测（胸X线、肺CT）、分子生物学检查（PCR技术）、结核菌素试验（旧结核菌素或纯化蛋白衍生物皮试）等常规操作诊断结核病，虽然对病情起到了一定的控制作用，但仍存在敏感性低、诊断效果不理想等诸多不足。因此，开发特异、敏感、快速、简便的结核杆菌感染的诊断方法已经成为全球共识。有研究发现，结核杆菌在特异性抗原的刺激下能释放出γ-干扰素，故临床上可用γ-干扰素水平来间接判断是否感染结核病即γ-干扰素释放试验（IGRAs）。因此，本研究选取了100例疑似结核感染患者通过回顾性分析以评价IGRAs在临床中的应用价值。

1对象与方法

1.1研究对象  选取2017年7月～2019年6月在景德镇市第一人民医院收治的100例疑似结核感染患者。本研究经医院伦理委员会批准，研究对象均知情同意并签署知情同意书。根据患者的临床症状，结合影像学、病理学检查、结核治疗有效性观察及《临床诊疗指南-结核病分册》中的相关标准[3]，将最终确诊48例结核病患者设为结核病组，其中男34例，女14例，年龄16～89岁，平均年龄（57.15±16.33）岁;非结核病患者52例设为非结核病组，其中男37例，女15例，年龄15～90岁，平均年龄（55.02±19.47）岁。另外选取该院体检中心50例健康体检者设为正常对照组。其中男35例，女15例，年龄18～85岁，平均年龄（53.20±16.19）岁。

1.2纳入与排除标准  纳入标准：①诊断明确，病历资料完善者;②健康体检者胸部X线及各项生理指标和身体机能基本正常。排除标准：①HIV阳性患者;②接受放、化疗以及免疫抑制药物治疗患者和合并糖尿病患者。

1.3仪器与试剂  IGRAs检测试剂购于武汉海吉力生物科技有限公司。免疫酶标分析仪为美国伯爵仪器有限公司（Bio Tek Instruments Inc） ELX800，洗板机为美国伯爵仪器有限公司ELX405。抗酸染色机为珠海贝索生物技术有限公司AUTO STAINER BSZ-GT116。显微镜为美国OLYMPUS CX21FS1。生物安全柜为济南鑫贝西生物技术有限公司BSC-1100ⅡA2-X。

1.4方法

1.4.1全血γ-干扰素释放试验（TB-IGRAs）  三组患者均于清晨空腹采用肝素抗凝采血管（美国BD制造）采集不少于4 ml的全血，打开生物安全柜的紫外灯照射15～20 min，3 h内将全血送至检验科，将采集的抗凝全血颠倒混匀20次，每次吸取1 ml分别分装至“N” （阴性对照）、“T” （检测）、“P”（阳性对照）3个培养管中。于37℃水浴箱中培养20～24 h后，3000～5000 r/min下离心10 min，小心吸取上清液于1.5 ml标记好的离心管中用于IFN-γ含量检测。IFN-γ含量的检测使用酶标仪法。酶标板中每个目标孔加入50 μl稀释液，然后再加入上述3个不同管上清液各50 μl，轻微振荡混匀，同时各取   100 μl按要求配置好的梯度校准品（6个浓度，每个浓度做2孔）按顺序加入板孔中，封板，置37℃温箱1 h;洗板，加入50 μl生物素抗体，封板，37℃温箱中温育30 min;洗板，每孔加入100 μl稀释后酶复合物（按稀释液：酶复合物=99∶1比例），37℃温箱中避光温育30 min;洗板，加入A、B显色剂各50 μl，充分混匀，置黑暗条件下反应15 min后加入50 μl反应终止液，立即用美国伯爵免疫酶标分析仪读取450 nm处的OD值（以630 nm为参考）。然后将N、P、T读取的OD值代入标准曲线分别得到N、P、T三个浓度值（IU/ml）。结果判读：T-N（IU/ml）≥0.35，且≥N/4判斷为阳性 。

1.4.2涂片抗酸染色镜检  三组患者均于清晨使用生理盐水漱口，咳痰，取带血或粘稠脓性的痰液;或非呼吸道样本（如脑脊液、胸腔、盆腔积液、尿液等），连续3 d送检。严格执行相关操作规程，观察油镜下的状态，若检见抗酸杆菌，则结果为阳性，若未见抗酸杆菌，则结果为阴性。具体操作方法为：新鲜干净玻片涂样→自然干燥→固定→石碳酸复红溶液加热染色5 min→水洗→3%盐酸乙醇脱色→水洗→亚甲蓝溶液复染1 min→水洗后干燥镜检，保持复红颜色为抗酸性细菌，蓝色为非抗酸性细菌。结果判断：油镜下所见抗酸菌数量为0，则报告阴性-;1～9个/100个视野，则报告1+;1～9个/10个视野，则报告2+;1～9个/个视野，则报告3+;>9个/个视野，则报告4+。

1.5评价指标  分析三组TB-IGRAs检测结果，对比涂阳肺结核和涂阴肺结核患者的TB-IGRAs阳性率，并分析TB-IGRAs与涂片抗酸染色对结核病的诊断效能。

1.6统计学方法  应用SPSS 12.0统计数据并进行分析。计量资料使用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料使用（n，%）表示，比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组TB-IGRAs阳性率比较  结核病组TB-IGRAs阳性率高于非结核病组和正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2肺结核病组涂阴与涂阳TB-IGRAs检测结果比较  涂阳肺结核和涂阴肺结核患者的TB-IGRAs阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3 TB-IGRAs与涂片抗酸染色对结核病的诊断结果比较  TB-IGRAs诊断结核病的敏感度为85.42%（41/48），高于涂片抗酸染色的22.92%（11/48）（P<0.05）;TB-IGRAs诊断结核病的特异性为89.22%（91/102），阳性预测值为78.85%（41/52），阴性预测值为92.86%（91/98），涂片抗酸染色诊断结核病的特异性为100.00%（102/102），阳性预测值为100.00%（11/11），73.38%（102/139），见表3。

3讨论

结核患者的细菌学检查是临床上常用的诊断方式，不仅可以作为制定治疗方案的标准，也是评价治疗有效程度的重要依据[4]。细菌学检查可分为直接镜检法和分离培养法，直接镜检法具有快速、方便有效的特点。但细菌学检查还存在一些缺点，如检查过程中可能出现假阳性，涂片阳性并非一定为结核分枝杆菌。镜检水平及实验室条件的参差不齐、标本中结核杆菌浓度必须大于5000条/ml、L-型结核杆菌对抗酸染色敏感度差导致结果有可能出现假阴性等，都会影响检查的准确性[5，6]。此外，该方法对结核病变部位在肺外的及菌阴性肺结核的诊断难度加大，造成症状加重，增加死亡率。影像学检查也是诊断结核病的常用手段，但当感染MTB患者症状不典型，病灶不明显时，影像学检查就无法做出准确诊断。结核病具有症状模糊、病情反复等特点，临床上常造成漏诊、误诊，不仅对患者身心造成伤害，也加重了家庭和社会的经济负担。因此，如何准确、快速的诊断结核病是近年来广泛医护人员关心的热点 话题。

1996年有学者在结核分枝杆菌内发现一段特殊的基因序列，该序列不存在于卡介苗菌株（BCG）和大部分非结核分枝杆菌（NTM）中[7]。当机体初次感染MTB时，T淋巴细胞会迅速过敏，当MTB再次入侵，特异性抗原ESAT-6和CFP-10会刺激活化的T细胞生成释放γ-干扰素，因此，通过测定是否有γ-干扰素的存在可作为评价机体是否感染结核病的一种方法。IGRAs法灵敏度高，且不受卡介苗和大部分非致病分枝杆菌的影响在诊断结核病中脱颖而出。本研究结果显示，结核病组TB-IGRAs阳性率（85.42%）高于非结核病组（15.38%）和正常对照组（6.00%），与国内[8-11]和国外[12]的研究数据相符。而IGRAs对涂阳和涂阴肺结核患者的诊断阳性率分别为88.00%、81.82%，两组间对比无明显差异，也凸显了IGRAs在菌阴性肺结核患者的应用优势。机体T细胞具有结核杆菌刺激记忆性，除完全治愈的患者外，IGRAs检测在潜伏及发病结核病患者中均呈阳性[13]。

本研究通过设置阴性对照和阳性对照能够更准确、客观的评价受试者是否患病。相较于细菌学检查的周期长、敏感性低的特点，IGRAs在卡介苗覆盖率广的地方及菌阴性结核、肺外结核的应用影响更为深远[14]。本研究中，IGRAs法敏感度为85.42%，阴性预测值为92.86%，IGRAs诊断结核病的敏感性和阴性预测值均高于涂片抗酸染色，说明在我国高结核感染率的背景下，阴性结果对于排除结核病的诊断具有重要意义。但特异性和阳性预测值低于涂片抗酸染色，因此在两者结果不相符的情况下，还需根据患者临床症状和其他实验室检查综合做出判断。有研究指出，在MTB的刺激下效应T细胞会大量聚集在病变部位（即脑脊液、胸腔积液、肺囊肿液等）释放γ-干扰素，即病变部位取样的IGRAs诊断结果会更优，但本研究取样部位为全血，还待将来以病变部位样本做进一步的研究。

综上所述， IGRAs阴性结果对于排除结核杆菌感染的价值更大，阳性结果对于菌阴性肺结核具有重要的辅助诊断价值，值得在临床中应用。

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收稿日期：2019-8-10;修回日期：2019-8-25

编辑/肖婷婷