内服结肠散的质量控制方法研究

吴艳蓉

内服结肠散为我院临床应用广泛、疗效显著的特色中药制剂，由黄芪、浙贝母、川贝母、海螵蛸、茯苓、延胡索(醋制)、白芍和甘草八味中药组成，具有益气健脾，理气止泻之功效，广泛用于慢性结肠炎、过敏性结肠炎、慢性腹泄、肠痉挛等症的治疗。目前，该品种的质量标准仅限于性状、显微鉴别和薄层鉴别，尚无含量测定的质量控制方法。该研究旨在建立其有效成分的HPLC含量测定方法，更好地对该品种进行质量控制。方中黄芪为君药。黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪药材中的重要活性成分，《中华人民共和国药典》2015版也以二者为含量测定的成分[1]。因此，本实验选择黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为指标，建立HPLC含量测定方法，作为内服结肠散质量控制的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津高效液相色谱仪(LC-10AT VP)，AnaStar 色谱工作站；电子天平(上海精天电子仪器有限公司，FA1104)。

1.2 试药甲醇、乙腈(色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)，正丁醇、氢氧化铵(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)，纯净水(杭州哇哈哈集团)。黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110781-01616，纯度为97.4%)，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110920-201304，纯度大于97.1%)，内服结肠散(5 g/袋，批号20180413)及阴性样品均由沈阳市肛肠医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷的含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Diamosil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm，迪马公司)；流动相：乙腈-水(34：66，v/v)；流速：1.0 ml·min-1；检测波长：200 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。分别取对照品、供试品和阴性对照品溶液适量，按以上色谱条件测定并记录色谱图，详见图1。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算不低于4000，与相邻峰的分离度大于1.5，系统适用性良好。

1.黄芪甲苷图1 黄芪甲苷对照品(A)、阴性对照品(B)和样品(C)的HPLC色谱图

2.1.2 溶液制备对照品溶液：精密称取黄芪甲苷对照品1.0 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.1 mg·ml-1的对照品溶液。供试品溶液：取内服结肠散5 g，加正丁醇50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液用氨试液洗涤2次，每次30 ml，弃去氨试液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30 ml，弃去水液，取正丁醇液蒸干，加入甲醇使残渣溶解，并转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过备用。阴性对照溶液：按内服结肠散处方工艺制备缺少黄芪的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察线性关系：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇分别制成浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 mg·ml-1的对照品溶液。分别精密吸取以上各浓度的对照品溶液20μl注入高效液相色谱仪。以质量浓度(x)为横坐标，以黄芪甲苷的峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，经计算得到线性回归方程为y=128140x+771.61，相关系数r=0.999 8(n=5)，表明黄芪甲苷的质量浓度在0.02～0.4 mg·ml-1范围内与峰面积具有良好的线性关系。精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，按“2.1.1”项规定的色谱条件重复进样6次，每次20μl，记录黄芪甲苷峰面积，计算RSD为1.1%(n=6)，表明精密度符合要求。稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别在第0、1、2、4、8、12 h按“2.1.1”项色谱条件进样分析，每次20 μl，记录黄芪甲苷峰面积，计算RSD为1.7%(n=6)，表明供试品溶液在12 h内稳定。重复性试验：精密称取内服结肠散6份各5.0 g，分别按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进样分析，记录黄芪甲苷峰面积，计算RSD为1.5%(n=6)，表明重复性良好。加样回收试验：取已知含量的内服结肠散(批号20180413)6份，精密称定，分别加入高、中、低三种浓度的对照品溶液适量，按“2.1.2”项下方法配制成供试品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进行测定，结果平均回收率为101.12%，RSD=0.78%(n=6)。结果见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收率试验结果 (n=6)

2.1.4 样品中黄芪甲苷含量测定结果精密称取内服结肠散样品，按“2.1.2”项操作配制供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进行测定，计算黄芪甲苷的含量为0.1687 mg·g-1。

2.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷的测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Topsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm，Welch)；以乙腈(A)-0.2%甲酸(B)为流动相[1]，按表2所列条件进行梯度洗脱。流速：1.0 ml·min-1；检测波长：260 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。取上述3种溶液适量，按以上色谱条件测定并记录色谱图，详见图2。理论塔板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算不低于3000，与相邻峰的分离度大于1.5，系统适用性良好。

表2 梯度洗脱条件

1.毛蕊异黄酮葡萄糖苷图2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(A)、阴性对照品(B)和样品(C)的HPLC色谱图

2.2.2 溶液制备对照品溶液：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品1.0 mg，精密称定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成浓度为0.1 mg·ml-1的对照品溶液。供试品溶液：取内服结肠散5 g，精密加入甲醇50 ml，称定重量，加热回流3 h，放冷，摇匀，滤过，精密量取滤液20 ml，蒸干溶剂，残渣加甲醇使溶解，并转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过备用。阴性对照溶液：按内服结肠散处方工艺制备缺少黄芪的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察线性关系：精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加甲醇分别制成浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 mg·ml-1的对照品溶液，分别精密吸取以上各浓度的对照品溶液20 μl注入高效液相色谱仪。以质量浓度为横坐标(x)，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积为纵坐标(y )绘制标准曲线，经计算得到线性回归方程为y=263079x+3509.8，相关系数r=0.9997(n=5)，表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷的质量浓度在0.02～0.4 mg·ml-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，按“2.2.1”项规定的色谱条件重复进样6次，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积，计算RSD为1.4%(n=6)，表明精密度符合要求。稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别在第0、1、2、4、8、12 h按“2.2.1”项色谱条件进样分析，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积，计算RSD为0.9%(n=6)，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。重复性试验：精密称取内服结肠散6份各5.0 g，分别按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样分析，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积，计算RSD为1.1%(n=6)，表明重复性良好。加样回收试验:取已知含量的内服结肠散(批号20180413)6份，精密称定，分别加入高、中、低三种浓度的对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法配制成供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件进行测定，结果平均回收率为100.73%，RSD=0.81%(n=6)。结果见表3。

表3 毛蕊异黄酮葡糖苷加样回收率试验结果 (n=6)

2.2.4 样品测定结果精密称取内服结肠散样品，按“2.2.2”项操作配制供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进行测定，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量为0.0846 mg·g-1。

3 讨论

内服结肠散方中以黄芪为君药。现代化学和药理学研究表明，黄芪药材中主要含有皂苷类、黄酮及其苷类和多糖成分[2]。黄芪甲苷是黄芪质量评价的传统指标[3]。黄酮类成分中以毛蕊异黄酮的含量和活性较高[4]，《中华人民共和国药典》(一部)2015版亦以二者为黄芪药材的含量测定指标[1]，因此，该研究以黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为指标，建立内服结肠散的含量测定方法。

由于黄芪甲苷的最大紫外吸收波长在200 nm左右，可通过紫外检测器进行测定，且紫外检测器是HPLC法中较为常用的检测器。因此，结合我院实际，在参考有关文献[5]的基础上，该研究选用紫外检测器用于测定黄芪甲苷的含量。

该研究参考了罗堃、刘富英、陈莉和刘桂花等人的文献报道[3，6～8]和2015版《中华人民共和国药典》(一部)黄芪药材项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法，对流动相进行了筛选，可满足样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷分离的要求。

该研究以HPLC法测定黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，得到样品整体分离效果良好，阴性对照无干扰，方法简便灵敏，为内服结肠散的全面质量控制提供了科学依据，丰富和提高了医院中药制剂的质量控制标准，有助于实现医院中药制剂的现代化研究，推进中药制剂的安全、有效、可控的良性发展[9,10]。