制首乌多糖Fe(Ⅲ)配合物的合成及吸附动力学研究△

李石清，袁强，蒋福升，张婷，张春椿

浙江中医药大学，浙江 杭州 310053

何首乌为蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块根。黑豆汁制后具有补肝肾、益精血、强筋骨等功效。其中，制首乌多糖为其主要有效成分，具有抗氧化、免疫调节和促进造血机能等作用[1-2]。因多糖分子中含有游离氨基(-NH2)和羟基(-OH)，在氮原子上，孤对电子可投入至金属离子空轨道中，与Zn2+、Cu2+、Fe3+金属离子反应，形成配合物[3-4]。本实验通过将精制的首乌多糖与FeCl3配合反应，研究其吸附动力学特性，为制首乌资源的利用及新型口服补铁剂的开发提供研究思路。

铁是构成人体必不可少的微量元素之一，可以促进发育，调节呼吸功能，增加机体的免疫力，治疗和预防因缺铁而引起的贫血。缺铁对人体发育、行为和智力、抵抗力等方面均有较大影响[5]。目前，临床上一般以亚铁Fe(Ⅱ)制剂作为常用补铁剂，但偶有胃肠道刺激等不良反应，在稳定性和生物利用度方面也存在一些问题，其在体内产生的内源性自由基，可能会导致细胞膜损伤[6]。有文献报道，中药提取物多糖Fe(Ⅲ)配合物作为补铁剂，具有生物利用率高，稳定性好等特点，对胃肠道副作用小。制首乌多糖作为其抗氧化、免疫调节和促进造血机能的主要有效成分，开发成补铁剂后有望起到补铁兼顾养血的功效[7]。

1 材料

TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；BS224S精密电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；DF-101S集热型恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)。

制首乌购于浙江中医药大学中药饮片厂，经浙江中医药大学中药资源研究所俞冰副教授鉴定为何首乌PolygonummultiflorumThunb.干燥块根黑豆汁制后的炮制品。实验所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 精制制首乌多糖的制备

取100 g制首乌药材，干燥，80%乙醇索氏回流脱色，挥干溶媒，加30倍量水浸泡1 h后，煎煮2 h，过滤，冷却，37 ℃水浴，加α-淀粉酶适量进行水解，至制首乌水提液与碘液反应呈阴性，100 ℃煮沸20 min除酶，浓缩至200 mL，氨水调pH至8，置50 ℃水浴锅中，边加H2O2边搅拌，直至呈现浅黄色，保温2 h，挥去多余氨，sevage法除蛋白，浓缩至25 mL，加3倍量95%乙醇，静置过夜，抽滤取沉淀，蒸馏水溶解，流水透析2 d，蒸馏水浸泡透析1 d，浓缩至20 mL，加4倍量的95%乙醇，抽滤，取沉淀，分别用无水乙醇、丙酮、乙醚润洗，真空干燥[3，8]，得粉红色精制多糖。

2.2 精制制首乌多糖Fe(Ⅲ)配合物的合成

称取制首乌多糖1.0 g、柠檬酸三钠0.5 g，分别加到250 mL三颈瓶中，用蒸馏水50 mL溶解。置于70 ℃水浴中，一边缓缓滴加10%NaOH溶液和2 mol·L-1FeCl3溶液，一边搅拌，控制溶液pH值为7～8。当出现棕红色不溶性沉淀时，立即停止滴加10%NaOH溶液和2 mol·L-1FeCl3溶液，继续在热水浴中搅拌1 h。待反应液冷却后，3500 r·min-1离心15 min。取上层深红棕色的液体，加入4倍量体积95%乙醇，静置，使红棕色沉淀物质沉淀完全。离心分离，沉淀物质分别用95%乙醇、无水乙醇和无水乙醚各洗3次以上，进行真空干燥，得到制首乌多糖Fe(Ⅲ)配合物(PIC)粗品。

将所得PIC粗品溶于纯净水，流水透析48 h以上，除去盐和小分子物质，浓缩，加入4倍量体积95%乙醇，醇沉，沉淀物分别用95%乙醇、无水乙醇、无水乙醚各洗2次，真空干燥，得无定形红褐色粉末的精制多糖Fe(Ⅲ)配合物1.02 g。

2.3 PIC的理化性质

2.3.1 PIC的一般物理性质 PIC是红褐色粉末，无臭、无味，易溶于水中，水溶液呈中性，不溶于无水甲醇、无水乙醇、乙醚等有机溶剂。

2.3.2 PIC的稳定性试验 透析除盐后的PIC易溶于水，用K4[Fe(CN)6]检验其水溶液[8]，未显示Fe3+的特性，证实PIC水溶液中不存在游离Fe3+，说明所生成的配合物较稳定。

2.3.3 PIC的水解实验 分别配制浓度为0.01 mol·L-1FeSO4、FeCl3、PIC(PIC中Fe3+浓度为0.01 mol·L-1)，准确吸取上述溶液20 mL，分别用0.01 mol·L-1NaOH标准溶液进行滴定，同时测pH值变化。结果，pH值为2.56时，FeCl3开始沉淀，pH值为6.67时，出现大量的沉淀物。pH值为3.45时，FeSO4开始沉淀，pH值为6.69时，出现大量的沉淀物。PIC在pH值3～12内均未出现沉淀，pH值<3时开始出现沉淀物，说明PIC在pH值3～12稳定。

2.4 制首乌多糖Fe(Ⅲ)配合物的吸附动力学研究

2.4.1 Fe3+含量测定 分别准确移取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL质量浓度为 10 μg·mL-1的标准Fe3+溶液，置于25 mL量瓶，再加入1 mL的10%盐酸羟胺溶液，2.5 mL的1 g·L-1邻菲罗啉显色液和5 mL的1 mol·L-1NaAc溶液，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀，放置10～15 min，以相对应试剂作为空白，于510 nm处测定吸光度。Fe3+浓度作为纵坐标，吸光度作为横坐标，得回归方程为：Y=6.137 3X-0.031 1，r=0.999 3。

2.4.2 吸附速率实验 在50 mL烧杯中，放入精确称取的制首乌多糖0.05 g，加纯净水19 mL，另取2 mol·L-1的Fe3+溶液1 mL混匀，置25 ℃恒温振荡容器中以100 r·min-1的恒速振荡，使其充分吸附，分别在15、30、60、90、120、180、240 min，取10 μL溶液，分别置于25 mL的容量瓶中，同2.4.1操作方法测吸光度，绘制其吸附动力学的速率曲线。因反应溶液中Fe3+溶液所加入量固定，制首乌多糖铁配合物含量不同，而随时间变化，表现出吸附变化曲线。结果见图1。

图1 制首乌多糖对Fe(Ⅲ)的吸附速率曲线

2.4.3 等温吸附实验 精密称取制首乌精制多糖0.05 g，平行5份，分别置50 mL带塞的三角锥瓶中，加蒸馏水19 mL，然后加2 mol·L-1Fe3+溶液1 mL，摇匀，分别置10、25、35、45、60 ℃恒温振荡器中，以100 r·min-1的恒速进行振荡。反应1 h，取10 μL溶液置25 mL容量瓶中，同2.4.1操作方法测吸光度，并绘制吸附等温线，因反应溶液中Fe3+溶液所加入量固定，制首乌多糖铁配合物含量不同，而表现出吸附曲线。结果见图2。

图2 制首乌多糖对Fe(Ⅲ)的吸附等温曲线

2.5 PIC还原性实验

精密称定PIC 0.2 g，置100 mL的容量瓶中，加蒸馏水、定溶至刻度，备用。分别取pH值为1、2、3、4、5、6、7、8的HCl或NaOH溶液85 mL，分别取PIC储备液10.0 mL于100 mL容量瓶中，并加入10%的抗坏血酸溶液3 mL，加入适量的稀NaOH或HCl溶液，定容，使溶液pH值为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，混匀，置37 ℃的水浴中进行还原反应[9]。在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h时，分别取还原液置25 mL容量瓶中，同2.4.1操作分别测吸光度。结果见表1。

表1 吸光度与溶液pH值及反应时间的关系

2.6 PIC红外光谱分析

红外光谱分析可用于研究分子的结构和化学键，也可以作为表征和鉴别化学物种的方法，本实验对制首乌多糖与制首乌多糖铁的红外谱图进行比较研究，并与文献报道的数据比进行较。

红外光谱图(图3)显示，在3500～3400 cm-1附近有强吸收峰出现，可能是由于制首乌多糖分子中有多个较强氢键作用的-OH存在，为制首乌多糖中羟基的伸缩振动吸收峰。通过制首乌多糖和制首乌多糖铁红外光谱对照，发现制首乌多糖的结构并没有因金属离子络合反应而发生改变。1023、1021 cm-1是分别与葡聚糖存在状态有关[10-11]。制首乌多糖铁在700、900 cm-1左右处的特征吸收与相关文献报道的β-FeOOH的特征吸收一致[12]，表明制首乌多糖配合物中的铁核可能是以聚合的β-FeOOH结构存在。

注：A.制首乌多糖；B.制首乌多糖铁。图3 制首乌多糖与制首乌多糖铁红外光谱分析谱图

3 讨论

本实验采用水提醇沉、脱色及透析等方法制备精制制首乌多糖，制备了制首乌多糖铁配合物，并确定了制首乌多糖铁配合物的理化性质：红褐色粉末，无味，不溶于无水甲醇、无水乙醇、乙醚等有机溶剂，易溶于水，并且其水溶液呈中性，其pH值3～12相对稳定。PIC水溶液中不存在游离的Fe3+，说明生成了相对较为稳定配合物。故口服后可避免游离铁离子对胃肠道造成刺激。

吸附动力学研究表明，在同一温度、不同时间下，制首乌多糖对Fe(Ⅲ)的吸附量随时间增加不断增大，并于1 h后基本达到稳定；在同一时间、不同温度下制首乌多糖对Fe(Ⅲ)的吸附量随温度的升高而逐渐增大。在相同pH值下、不同时间下，PIC的还原性随时间不断增大于2 h后基本达到最大；在同一时间、不同pH值下，PIC的还原性随pH值的升高而逐渐增大。

铁在人体发育中具有重要的作用，可以促进发育，调节呼吸功能，增加机体的免疫力，治疗和预防因缺铁而引起的贫血。缺铁对人体发育、行为和智力、抵抗力等方面均有较大影响。补铁剂使用不当，可在体内产生内源性自由基，会导致细胞膜损伤。中药提取物多糖Fe(Ⅲ)配合物作为补铁剂，具有生物利用率高，稳定性好等特点，对胃肠道副作用小。经黑豆汁制后的何首乌不仅具有补肝肾、益精血、强筋骨等功效，而且其主要有效成分多糖具有抗氧化、免疫调节和促进造血机能等作用，制何首乌经水提醇沉法提取物质主要为多糖类成分，相对安全性高，而且释放出铁后的配体多糖还具有多种生物活性，可能有兼顾造血与补铁作用，故PIC可能有较高的生物利用度，有望成为一种新型的口服补铁剂。