AKR1B10在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其临床意义

彭旭红 李佳 王玉，3 张健 罗伟濠 朱乐攀 胡政 吴海燕 李艳兰 段丽丽

作者单位：423000 郴州 1郴州市第一人民医院超声医学中心；2郴州市第一人民医院转化医学研究所；065201 廊坊 3燕达医院研究院中心实验室；423000 郴州 4郴州市第一人民医院检验医学中心；5郴州市第一人民医院病理诊断中心；421001 衡阳 6南华大学衡阳医学院病理学教研室

甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，发病率呈逐渐上升趋势［1］，而甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的病理类型，占TC的85%～90%［2-3］。甲状腺癌原发灶的解剖位置位于颈部皮下，有利于超声引导下穿刺活检，手术和131碘治疗是主要的治疗方法，10年生存率可达90%以上［4-5］。尽管多数甲状腺癌患者预后较好，但仍有部分患者因转移和复发死亡［6］。寻找特异性的肿瘤标志物对甲状腺结节良恶性的早期诊断、预后评估和复发监测均具有重要意义［7-8］。醛酮还原酶1B10（aldo-keto reductase family 1B10，AKR1B10）属于醛酮还原酶（aldo-keto reductase，AKR）超家族，研究发现其在乳腺癌［9］、肝癌［10-12］、肺癌［13］、口腔癌［14］等肿瘤组织中高表达，且与肝癌和乳腺癌肿瘤大小、淋巴结转移呈正相关，但其与PTC的关系未见报道。本研究检测AKR1B10在PTC中的表达，并分析其临床病理特征的关系，为临床诊疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年1月至2015年7月于郴州市第一人民医院经超声诊断的237例甲状腺结节患者的病理标本，其中甲状腺乳头状癌117例、结节性甲状腺肿40例、甲状腺滤泡性腺瘤40例、桥本甲状腺炎40例。同时选取本院病理科法医尸检福尔马林浸泡的甲状腺正常组织13例作为对照。纳入标准：⑴术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗；⑵经常规石蜡病理确诊；⑶临床资料齐全。排除标准：合并其他肿瘤或治疗后复发患者。收集患者性别、年龄、发病部位、有无淋巴结转移、周围浸润情况、肿瘤大小、肿瘤TNM分期等临床资料。本研究经郴州市第一人民医院伦理委员会批准（批准号：2015002），患者知情同意。

1.2 主要材料

AKR1B10抗体为自制兔抗，β-tubublin抗体购于上海碧云天生物有限公司；山羊血清，磷酸缓冲液（PBS）（pH 7.2～7.4），枸橼酸抗原修复液（pH 6.0），浓缩型DAB试剂盒，HRP标记山羊抗兔IgG和HRP标记山羊抗鼠IgG购于北京中杉金桥生物技术公司；聚丙烯凝胶电泳和转膜装置购于美国Bio-Rad公司。

1.3 蛋白免疫印迹实验检测AKR1B10蛋白的表达

在超声引导下或外科手术中切取甲状腺癌新鲜组织30例和甲状腺癌患者正常甲状腺新鲜组织6例用于蛋白免疫印迹实验。甲状腺组织剪碎后，加入蛋白裂解液提取总蛋白，测定蛋白浓度；以每个样品50 μg蛋白进行聚丙烯凝胶电泳，转膜，封闭；一抗（孵育的一抗分别为 AKR1B10 和 β-tubulin，稀释比例 1∶1 000）孵育，4℃冰箱过夜，用PBST洗涤液洗涤3次，每次5 min。加入二抗（按 1∶5 000 稀释），室温孵育 2 h，用PBST洗涤液洗涤3次，每次5 min。采用ECL化学发光液显影，以β-tubulin作为内参，扫描AKR1B10和β-tubulin条带灰度值，以 AKR1B10/β-tubulin的灰度值表示AKR1B10的表达水平。

1.4 免疫组织化学法检测不同甲状腺组织中AKR1B10蛋白的表达

从病理科收集石蜡包埋甲状腺组织样本，包括甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、甲状腺滤泡性腺瘤、桥本甲状腺炎，采用SP法，连续4 μm切片，常规脱蜡、脱水；阻断灭活内源性过氧化物酶（3%H2O2孵育后PBS冲洗）；抗原修复（标本置于pH为6.0的枸橼酸缓冲液中）；血清工作液封闭30 min；滴加AKR1B10抗体，4℃孵育过夜；滴加通用型二抗，置于37℃温箱孵育1 h；DAB显色，苏木素复染；脱水、干燥、封片。每张切片于高倍镜（×400）下随机选取5个视野，采用染色强度（无色为0分，淡黄色1分，深黄色2分，黄褐色3分）和染色面积（0～5%计0分，6%～10%计1分，11%～50%计2分，50%以上计3分）双重指标综合判断阳性表达情况，两项指标评分相乘，结果＜2分计为“-”，2～3分计为“+”，4～5分计为“++”，6分以上计为“+++”［15-16］，++～+++视为 AKR1B10 阳性表达，-～++为AKR1B10阴性表达。为降低人为误差，由2名医师分别在镜下评分，结果取平均值，评分差异较大的结果请病理科专家会诊。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行数据分析。AKR1B10在不同甲状腺组织中的表达差异比较采用χ2检验，当理论频数小于1时，采用Fisher确切概率法。AKR1B10在甲状腺正常组织和PTC组织中的差异性表达比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AKR1B10在甲状腺正常组织和PTC组织中的表达

采用Western Blot检测结果显示AKR1B10蛋白在PTC组织中的表达水平高于甲状腺正常组织（0.82±0.10vs0.22±0.07，t=2.702，P=0.011）。见图 1。

图1 AKR1B10在甲状腺正常组织和PTC组织中的表达Fig.1 Expression of AKR1B10 in normal thyroid tissues and PTC tissues

2.2 AKR1B10在甲状腺癌组织中的表达

免疫组织化学法结果显示，AKR1B10在PTC组织中呈高表达，主要表达于细胞质内，不均匀分布，细胞染色深浅不一。见图2。

图2 PTC组织中AKR1B10的表达（×400）Fig.2 Evaluation standard of AKR1B10 expression in PTC tissues（×400）

2.3 AKR1B10在不同甲状腺组织中的表达

AKR1B10在PTC组织中阳性表达率最高（79.5%），在桥本甲状腺炎组织的阳性表达率次之（75.0%）。PTC组织中AKR1B10阳性表达率与桥本甲状腺炎组织的比较，差异无统计学意义（χ2=0.346，P＞0.05），但与结节性甲状腺肿组织、甲状腺滤泡性腺瘤组织、PTC癌旁组织、甲状腺正常组织比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

表1 AKR1B10在PTC癌组织和甲状腺良性组织中的表达Tab.1 Expression of AKR1B10 in PTC and in benign lesions of thyroid tissues

2.4 AKR1B10表达与PTC临床病理特征的关系

共收集106例PTC患者完整的临床病理资料，其中94例可准确分期，AKR1B10表达与癌组织周围淋巴结转移有关（χ2=8.059，P=0.007），男性患者 AKR1B10的阳性表达率高于女性（91.0%vs60.7%，χ2=8.509，P=0.010）。见表 2。

3 讨论

近年来，甲状腺癌发病率持续快速增长，临床诊断甲状腺结节性病变的方法较多，对疑似患者先进行影像学诊断，如CT检查、超声检查等，再行超声引导下穿刺病理活检。以外科手术为主的综合治疗是甲状腺癌患者目前的主要治疗手段，治疗效果较好，但仍有患者发生转移和复发［6］，面临二次手术风险。目前应用于临床的甲状腺癌标志物较少［17-18］，没有理想的诊断及标志物。AKR1B10是醛酮还原酶家族成员之一，主要还原内源性代谢产生的和外源性摄入的醛酮类物质，以保护细胞免受羰基毒性损伤，减少DNA损伤和突变。AKR1B10还可与乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）结合，保护后者泛素化途径降解，从而促进脂质合成，促进肿瘤细胞生长。AKR1B10主要在正常胃上皮和肠道上皮组织中高表达，在其他组织中不表达或低表达［19］。

本研究发现，AKR1B10在PTC组织中阳性表达较率高，乳头状细胞起源于甲状腺滤泡上皮细胞，因此AKR1B10可能在滤泡上皮细胞癌变进展过程中发挥一定作用。前期研究发现在乳腺癌细胞中AKR1B10可通过激活ERK信号通路，上调MMP2，从而促进乳腺癌细胞迁移和侵袭［20］。本研究进一步分析AKR1B10表达与PTC临床病理特征的关系，发现其与淋巴结转移有关，可能与AKR1B10在乳腺癌中的作用类似，但仍有待进一步验证。本研究中男性患者的AKR1B10阳性表达率高于女性患者，原因不明。甲状腺癌好发于女性，男女比例约为1∶3［21］，而本研究中男性患者较少，因此后期需增加男性患者例数验证此结果。

表2 AKR1B10表达水平与PTC患者临床病理特征的关系Tab.2 Correlation analysis between AKR1B10 expression levels and clinicopathological parameters of PTC

本研究还发现，AKR1B10在40例桥本甲状腺炎组织中表达较强，阳性表达率为75.0%，明显高于甲状腺正常组织及其他甲状腺良性组织，但其与PTC组织中AKR1B10的阳性表达率（79.5%）差异无统计学意义。文献报道［22］，桥本甲状腺炎患者较非桥本甲状腺炎患者存在更高的甲状腺癌发生风险。说明桥本甲状腺炎具有恶变成甲状腺癌的可能，AKR1B10可能是评估桥本甲状腺炎恶变的标志物。

综上所述，AKR1B10在甲状腺乳头状癌组织中呈高表达，且与甲状腺癌周围淋巴结转移有关，有望作为评估转移的标志物，为临床诊疗提供参考依据。