结直肠癌检测的生物标志物研究进展

陈晓菲，高 媛，尤洪兰，张红明，于 农

（苏州高新区人民医院检验科，江苏 苏州215129）

癌症是世界范围的健康问题，也是很多国家人口死亡的主要原因［1］。全球每年都有约140万例恶性肿瘤病例，死亡人数达到70万人。其中，结直肠癌（CRC）是位居全球恶性肿瘤的第三位，其死亡率也位居第四位［2］。最近的一项估计表明，到2030年，预计将增加60%的结直肠癌病例，也就是即将有超过220万例新病例，死亡人数也将达110万［3］。作为癌症发病人数全球第一的中国，国家癌症中心于2017年11月发布了《中国肿瘤的现状和趋势》，报告中指出，结肠直癌在我国无论是发病率还是死亡率都一直稳居前五的位置，提高对于结直肠癌的认识刻不容缓。对于结直肠癌的检测、诊断、治疗，可以为预防结直肠癌恶化提供有效的手段，提高结直肠癌治愈率及患者生存率［4］。

为完善对结直肠癌的预测和预后，美国癌症联合委员会更新了癌症分期系统，在结直肠癌的检测方法中增加了新的预后和预测因素，以便于基于组织病理学以及分子生物学的非侵入性诊断方法的应用。推荐的方法中，除了临床解剖学特征指标，还包括常规检测抗原、相关蛋白激酶、特征基因改变检验等多种方法。开发出更多的肿瘤检验生物标志物，有利于精确地诊断结直肠癌的阶段和预后，为结直肠癌治疗提供最直观的建议。

1 常规结直肠癌检验标志物

常规血清癌胚抗原（CEA）、糖蛋白抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9）与某些组织分子相关的值是常用的结直肠癌预测及预后检验诊断的生物标志物。其中，癌胚抗原是在结直肠癌治疗和后期进行监测的具有公认功效的肿瘤标志物，也是目前已知指南中推荐用于CRC监测和预后的唯一血液标志物［5］。癌胚抗原是在1965年被发现的，最初，它被认为是具有结直肠癌特异性的，但随后的研究发现在其他组织如胰腺、胃、支气管、乳腺等癌症中也能检测到该抗原。从预后的角度来看，在患者术前通过检验手段确定CEA水平，有助于确定患者预后的预期寿命［6］。持续升高的CEA水平就可能指示肿瘤组织存在浸润或者转移，术后CEA水平缓慢增加是肿瘤局部复发的典型症状，而动态升高则说明可能肿瘤已经转移［7］。

最初，CA 19-9是在人类结直肠癌细胞系中鉴定出来的黏蛋白样产物，它是在正常人组织中表达的肿瘤相关抗原而非肿瘤特异性抗原［8］。其在血清中水平升高是诊断上消化道腺癌和结直肠癌的重要标志物，CA 19-9水平升高是检验肿瘤预后不良的因素。

然而，目前的一系列研究结果说明在诊断时仅使用CEA或CA 19-9缺乏灵敏度和特异性［9-10］，尤其CA 19-9对于肿瘤的的灵敏度远低于CEA［11］。因此，需要发现更多的结直肠癌检验诊断的生物标志物。目前，FDA也已经批准了CRC早期诊断的甲基化标志物进行商业实验，如SEPT9、NDRG4、BMP3等（商品名EpiproColon®和Cologuard）［12-13］，然而，从预后或者预测的角度来看，临床上还是没有出现最适合的标志物。

2 新检验标记物的发现

随着诊断医学和分子病理学的发展，人们对于信号通路的研究越来越深入，发现了众多肿瘤检验相关的标志物，随着这些标志物数量的增长，代表了肿瘤高度多样化的生物结构以及不同的细胞阶段。在肿瘤发展过程中，相关标志物的水平可能是动态的，即使是在相同疾病的不同患者体内，典型的肿瘤标志物也可能各不相同。因此，确认在结直肠癌患者体内不同的肿瘤检验标志物对于个体化精准治疗的实施也具有很重要的意义。基因工程的发展更有利于建立完善的预测和预后体系，为结直肠癌的治疗从群体化向个体化发展以及个性化用药的实现提供基础。目前对新的结直肠癌生物标志物的发现集中于蛋白质组学、基因组学及其他相关方面的研究。

2.1 结直肠癌相关蛋白标志物

作为目前癌症治疗的一个重要策略，血管生成相关的特异性生物标志物的表达研究在结直肠癌预测预后指标的建立中有很大的潜力［14］。通过对正常细胞和恶性结直肠组织血管内皮细胞的基因表达分析显示，肿瘤内皮细胞内特异性升高的46个转录物中，有9种转录物可能与肿瘤发生相关，命名为肿瘤内皮标志物（TEM）。TEM在人类肿瘤内皮中的表达量是正常细胞的20倍，可能有助于区分肿瘤和正常内皮细胞［15］。其中TEM1可能是由肿瘤细胞大量繁殖造成高密度及缺氧环境调控表达，其在远端正常黏膜和原发肿瘤间基质中表达显著增加，说明TEM1可能参与肿瘤侵袭（进展和转移）。因此，可以设计靶向TEM1的抗体用于肿瘤的治疗。TEM5和TEM7也与肿瘤相关血管系统的过度表达有关［16］，TEMs的检测也较为简便，可以是未来肿瘤检验的一个有用标志物。

肿瘤向远端转移的一个重要因素就是淋巴结转移，在结直肠癌中，有多个蛋白与淋巴结转移呈正相关，这些蛋白标志物可以用于表征体内存在侵袭性的原发肿瘤，可以作为评价肿瘤预后的蛋白标志物。其中，受体-酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）的过度表达就与某些肿瘤的不良预后相关［17］。Western blot和免疫组化结果显示，ROR1在结直肠癌中的表达明显高于癌旁正常组织。同时，ROR1表达与临床分期和淋巴结转移呈正相关（P＜0.01）。生存分析显示，ROR1表达较高的患者总生存期明显缩短（P＜0.01）。说明ROR1表达与恶性属性相关，并且可以作为结肠直肠癌检测的新型预后标志物和治疗靶标。另一个结直肠癌转移潜在标志物丝氨酸-苏氨酸激酶31（STK31），在淋巴结转移患者体内的表达水平显著升高［18］。免疫组化和实时定量PCR检测结果显示，STK31的表达高于淋巴结样品中的RNA水平和蛋白质水平，因此也可能是监控和预测结直肠癌转移风险的潜在生物标志物。同样地，通过免疫组化方法比较肿瘤组织与非肿瘤邻近组织中醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）的表达，结果显示，CRC组织中ALDH1A1蛋白表达显著增加。在CRC患者中，ALDH1A1蛋白表达增加与淋巴结转移的存在显著相关：N0病例中为64.28%；N1例病例占75.49%；在N2情况下为82.14%，（P＝0.002）。因此，CRC组织中ALDH1A1蛋白的表达可能是CRC患者的潜在预后标志物［19］。

质谱技术的发展给候选蛋白的验证带来了新的方法。选择性反应监测（SRM）是一种具有高分辨率高精度的靶蛋白组学方法，三重四极质谱仪即可以完成该检测。通过这种方法可以验证多个候选的结直肠癌生物标志物［20］。有研究利用SRM进行靶向蛋白质组学分析估算患者血清胞外囊泡成分中的候选蛋白，确定了一些潜在的早期诊断结直肠癌的生物标志候选物。通过对SRM验证得到的37个肽进行ROC分析，发现其中有3个肽类是高度敏感，AUC在0.7～0.9，而通过SPSS软件进行基于逻辑回归的候选标志物组合分析发现，将肽类进行组合后，得到的灵敏度可以进一步提高。特别是有8种肽类组合的AUC均大于0.9，其中，转铁蛋白受体蛋白1、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白、血管生成素-1这三种蛋白组合的AUC可以达到0.97，说明多种标志物结合可以提高CRC早期诊断的准确性。而在SRM验证的肽类中，有17种肽类的灵敏度都超过了CEA［21］。

2.2 结直肠癌相关核酸标志物

微卫星不稳定性（MSI）是微卫星染色体的编码和非编码序列的变化，比如重复的DNA序列的增殖或丢失，这会导致肿瘤细胞中微卫星区域的缩短或延伸。错配修复基因（MMR）可以消除这些突变，因此，MSI可能是由这些基因的突变引起的［22］。微卫星不稳定性可分为微卫星不稳定性高（MSI-H）和微卫星不稳定性低（MSI-L），这取决于与MSI特征相关基因座的百分比。在CRC II期和III期患者的回顾性研究分析中发现，无论癌症的进展如何，MSI-H都是改善总体生存的预测因素，与MSI-L或缺乏MSI特征的肿瘤细胞相比，淋巴结转移和远处转移的发生率较低［23］。MSI可能是预后的一个重要检测因素。

DNA基因的突变也是肿瘤细胞大量增殖的重要原因。研究发现，12号染色体短臂上第12位密码子（80%的患者）或13位密码子的KRAS基因突变可以作为患者接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗的生物标志物［24］。在许多实体瘤中都存在编码磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的p110α催化亚基的基因突变，包括CRC。PIK3CA基因在10%～20%的CRC肿瘤中发生突变。与PIK3CA野生型肿瘤患者相比，PIK3CA突变肿瘤患者的结直肠癌特异性死亡率增加［25］。在患有KRAS野生型肿瘤的患者中，PIK3CA突变的存在与结直肠癌特异性死亡率的显著增加相关。相反，PIK3CA突变对KRAS突变肿瘤患者的死亡率没有显著影响。而对于伊立替康治疗患者来说，其UGT1A1基因多态性又是潜在毒性的重要生物标志物。在使用伊立替康治疗前检测其UGT1A1基因，可以避免产生严重不良反应。上述结果说明不同基因位点的突变可能独立影响了肿瘤的预测或者预后效果，因此，也有必要对于肿瘤患者基因组中特定生物标志物进行检测，以利于个体化精准化治疗的顺利实施。

在过去十年中，对小RNA（miRNA）功能的研究改变了我们对细胞和疾病的理解，尤其是在癌症生物学方面。因此，越来越多的人开始将它们作为癌症治疗过程中能够揭示疾病进展和预后的生物标志物的候选物［26］。基于miRNA的分析是非侵入性的，它们在癌症检测过程中具有高度的灵敏度，选择性和特异性。另外，用于miRNA分析的工具简便易用，如实时定量PCR［27］。目前已经发现许多具有生物标志物潜力的miRNA。使用微阵列检查来自相同CRC患者的血浆外泌体，原发性肿瘤组织和肝转移组织的miRNA谱。结果显示，在三者中，miR-21水平都高度上调。高外显子-miR-21患者的总生存率和无病生存率明显低于低miR-21患者。血浆外泌体miR-21水平检测是用于预测II期，III期或IV期CRC患者的复发和预后不良的重要生物标志物［28］。WANG等［29］研究了CRC中的miRNA-552水平。他们指出也可以使用miR-552作为生物标志物来进行CRC预后不良的预测。事实上，miR-552促进肿瘤细胞增殖和迁移，在晚期的CRC中表达水平也更高［30］。

也有研究显示，miR626852在CRC组织中与邻近的正常组织相比表达不足，miR626852的过表达能显著抑制CRC细胞的增殖和侵袭。miR626852的表达与CRC转移呈负相关，而与患者预后呈正相关。进一步的研究显示，TCF7是CRC细胞中miR626852的直接靶标。过表达miR626852可显著抑制CRC细胞中TCF7的mRNA和蛋白水平［31］。miR626852通过靶向TCF7可以在CRC治疗中起抑制肿瘤的作用，这也是CRC临床检验的一个潜在指标。

另外，包括CRC在内的很多肿瘤中，都存在启动子高度甲基化引起的肿瘤相关基因的表观遗传沉默。在很多CRC患者的血液中都能检测到肿瘤特异性的DND甲基化，研究发现，在CRC患者中，MAL、SEPT9、TAC1、NELL1、CRABP1、SST及EYA4这七个基因甲基化程度更高［32-33］。这些血清中甲基化的基因对于CRC预后或预测具有一定的潜力。血清中另一类标志物，长链非编码RNA（lncRNA）也是宿主-肿瘤应答的重要介质。如Gas5与结肠癌大小就呈负相关［34］，lncRNA UICLM则作为miR-215的一种竞争性的内源RNA，即ceRNA，调控ZEB2的的表达，促进结直肠癌转移瘤的发生［35］。而lncRNA h19可以与miR-138和miR-200a竞争，拮抗其功能，影响上皮-间充质转化过程，促进肿瘤发展，从而作为预测的的标志物［36］。以上研究说明lncRNA可能同时涉及多个基因的表达，调节肿瘤进展过程中的多个途径，对其进行检测，可能有利于更好地对CRC进行预测或预后分析。

2.3 结直肠癌相关其他标志物

最近的研究表明，基于生物流体的代谢组学也可以识别潜在的CRC诊断代谢标志物。采用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）249例CRC患者的血清代谢产物发现，CRC患者有明显的代谢特征，其中，有72个代谢产物有特征性表达，涉及了三羧酸（TCA）循环、尿素循环、谷氨酰胺、脂肪酸和肠道菌群代谢，均与正常人群不同［37］。在CRC患者中，油酸、鸟氨酸是具有最显著差异的两种代谢产物，丙酮酸盐在CRC患者中的水平也高于健康对照组，而一些TCA循环中间产物，如富马酸和顺式乌头酸，在CRC患者中呈现耗竭状态。另外，在CRC组织中氨基酸水平高，而血清中氨基酸缺失，这可能是由于癌细胞中氨基酸消耗量增加所致。有报告显示CRC患者溶血酶水平降低，脂肪酸合成酶表达增加。也有研究发现，CRC男性患者粪便脂肪酸代谢组特征的变化，尤其是总ω-6多不饱和脂肪酸中的亚油酸水平，显著高于健康男性，因此，粪便脂肪酸也可能是CRC检验工作中的新型筛查工具［38］。这些代谢变化是有标志性的，因此，采用一组血清代谢产物标志物作为CRC预测的方法也具有很大的潜力

除了常规标志物，目前也发现了很多其他类型的生物标志物。比如年龄对于MSI的影响。在老年人（≥50岁）群体中，高患病率（79%）与MSI中MLH1基因丢失相关，这种MMR失活模式是由甲基化沉默来驱动的［39］。而在≤30岁的CRC患者中，出现了广泛的MMR基因丢失与BRAF突变，这与老年人MMR有所不同［23］。另外，也有研究显示，活化凝血系统的程度与某些恶性肿瘤（包括结直肠癌）的肿瘤分期和预后相关［40］。纤维蛋白降解的终产物D-二聚体在较大肿瘤，淋巴结转移和血管入侵的患者中显著升高。在另一项试验中，晚期和复发性CRC患者中血浆D-二聚体水平高的患者存活率明显缩短［41］。肿瘤基质细胞对尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）的结合激活纤溶酶原，u-PA的生物活性对局部侵袭和远处转移起重要作用。这种侵袭性在临床上反映为升高的纤维蛋白降解产物，即较高的D-二聚体水平与较高的疾病阶段。因此，在凝血和纤维蛋白溶解系统中的肿瘤相关降解产物的检测可用作肿瘤负荷和结果的预测因子。

个体化精准治疗的发展，给CRC治疗过程中用药的选择性也带来了新的挑战，如部分CRC患者表现出5-Fu抵抗，有相关研究显示，lncRNA h19可以作为ceRNA，作用于miR-194-5p，影响其与靶点SIRT1的结合，从而触发自噬，形成化学抵抗，影响5-Fu化疗效果［42］。MSI与MMR也是影响氟尿嘧啶类药物疗效的原因。而对于肿瘤治疗的另一利器，抗体药物来说，其作用靶点的状态，更是CRC预后检测的重要因素。在中国结直肠癌诊疗规范（2015版）中，就推荐确定为复发或转移性结直肠癌的患者检测KRAS、NRAS、BRAF基因状态，这些基因突变的患者，都有可能对单抗药物治疗无效。随着各种凝胶电泳、水凝胶以及纳米材料传感器等检测技术的蓬勃发展，也有各种不同的新型技术应用于新型生物标志物的发现活动中。

3 展望

目前对于CRC新的生物标志物的研究还在不断进行，无论是蛋白质组学还是基因组学都将涌现越来越多的生物标志物。将它们组合应用于CRC的检验工作和预后评估，并针对不同生物标志物的水平进行靶向治疗，未来有可能实现精准化、个体化的CRC治疗以及CRC死亡率的改善。