工程纳米材料毒理学的研究现状与研究方法评价

沈建云，温海燕，姜 楠，周 萌，邢 本，姜双林，*

(1.阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，安徽 阜阳236037)

工程纳米材料（engineered nanomaterials，ENM）是一种三维空间至少有一处小于100 nm的人造材料。因ENM独特的理化性质，使其在纳米药学和纳米医学领域具有良好的应用前景，与此同时，其对人类健康存在的潜在不利影响也不容忽视。如报告显示，较小的纳米颗粒更具有生物活性，可能显示出毒性作用。因其易穿过皮肤、肺以及血脑屏障，可能与其他生物系统相互作用[1]。因此，最大限度地降低ENM可能的不良健康影响相关的风险非常重要。由于本体化合物获得的数据不能直接应用于纳米材料，ENM的毒性测试较复杂，需要研究其潜在的机制，例如氧化应激、免疫毒性和遗传毒性，并考虑其可能的副作用。已有的常规化学品准则的一些研究方法也可用于测试ENM。然而，关于ENM的剂量测定、分散性和细胞摄取、ENM与细胞和组织器官的相互作用等研究方法存在着明显的局限性。因此，需要开发针对ENM的标准化和有效测试的毒性研究方法。另由于ENM的独特的理化性质、生物有效性和环境行为等，亟需特定的纳米安全性或毒理学研究方法，以保证其研究方法的适用性。

本文系统综述了ENM的理化性质、表征、暴露方式、毒理评价以及安全性等关键问题。

1 ENM的暴露评估和表征

ENM的理化性质随着环境、空气、液体或固体（例如食物、药物）而发生变化。因此，在评估暴露时，应考虑纳米材料整个生命周期，包括从生产到应用和处置[2]。在纳米医学中，暴露的风险群体是患者、应用ENM的医务人员以及在ENM制造期间暴露的生物技术专家。可能接触的主要途径是静脉注射、手术植入、吸入、口腔和皮肤接触。在处理/回收和释放到环境中之后，可能通过废物流接触可以进行二次暴露ENM。

当ENM处于悬浮液中时，可能发生沉淀，聚集或附聚。因此，除了在研究ENM进入体内的动力学时，还应在储备溶液和施用期间使用的基质中对ENM进行表征,对ENM的表征应实施标准化指南，并且在此过程中获得的信息与研究终点相关。基本的指标包括：平均尺寸、粒度分布、表面积、化学成分、表面电荷和反应性、形状、溶解度、相关介质中的聚集倾向、结晶度、孔隙率和样品纯度[3-5]。表征通常通过光学光谱学、电子显微镜、X射线衍射、光散射、磁共振、质谱、色谱、zeta电位测量、热技术和圆二色性来实现[6]。在考虑如可用性、选择性、精度、非破坏性、成本、简单性和对特定材料的亲合力这些因素的基础上，这些技术可单独使用，也可组合使用。目前仍然缺乏用于建立安全剂量的ENM的暴露和危害评估的认证参考标准。

2 ENM的生物动力学、摄取和转移

ENM通过生物屏障转移到不同的组织而进入体内。这可能受其尺寸、形状、反应性、表面涂层和表面电荷的影响[7]。小尺寸和颗粒形状能够吸收血液和淋巴，循环并分布到通常受生物屏障保护的身体组织中。ENM的固有理化性质将强烈影响体内动力学，并随后影响靶器官和毒性。虽然纳米医学中ENM的设计具有高目标特异性，并因此降低了非靶细胞和组织的毒性，但在应用于人类之前探索潜在的毒性非常重要。ENM可与体内的生物大分子结合，从而促进细胞摄取，导致机体慢性和退行性改变[8]。ENM的细胞摄取机制包括扩散、吞噬、胞饮作用和受体内吞作用。当前细胞ENM摄取水平的定量分析方法通常使用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)的方法。ENM 可以穿透细胞膜和体内的上皮或内皮屏障。表面积和成分决定了其反应性、分散性、与生物环境（包括生物大分子）的相互作用，从而决定了ENM毒性复杂性。用于药物递送的ENM能有效的穿过生物屏障（如血脑屏障、胎盘屏障和睾丸屏障等），一旦被吸收，它们可能会沉积在身体里。由于它们的小尺寸或特定的功能化，ENM可跨越重要的生物屏障，并对异常敏感的系统（例如大脑或发育中的胎儿）造成毒性。已有研究表明，ENM可在体内诱导遗传毒性作用[9]。ENM可以通过血液运输并积聚在二级靶组织和器官中并可能产生不利影响。但是ENM生物分布和毒性机理在很大程度上仍然是未知的。

3 ENM的体外毒性试验

体外毒性评估对于研究纳米材料对生物实体的作用机制至关重要[10]。体外毒性评估可分为增殖，凋亡，坏死，氧化应激和DNA损伤测定[11]，常用方法涉及分子、荧光、化学发光和分析策略[12]。理想情况下，ENM的毒性试验应涵盖所有可能的毒性终点，如ROS生成、细胞活化、炎症、免疫毒性和基因毒性，以及其他一般终点，包括致癌性、心血管毒性、神经毒性、生殖和发育毒性。除了剂量和暴露时间外，还必须考虑如尺寸、形状、表面性质、组成、溶解度、聚集/附聚、ENM摄取以及与ENM相关的毒素和过渡金属的存在。而使用的细胞类型可以影响毒性测试的结果。

ENM的细胞毒性作用机制很多，然而，最常报道的机制是ENM诱导的活性物质的产生，其可以诱导细胞脂质，蛋白质和核酸的损伤或导致显著的炎症反应[13-16]。ENM除了引起氧化应激、炎症和基因毒性之外，其他如心血管、免疫学和神经系统疾病以及可能的其他影响也引起了关注。研究发现，金属和金属氧化物纳米颗粒与主要神经退行性疾病显著相关[17]。

3.1 体外模型

研究与不同ENM相关的生物学效应的模型系统应来自靶器官或直接在特定器官和组织中的细胞或组织水平。经合组织建议用培养人体细胞的人体模型系统用于体外测定，因为它们可用于预测ENM在人体中的毒性。现有的体外试验在评估ENM的生物危害方面（不包括表征）存在局限性。一般使用原代细胞培养物或不同来源的转化细胞系（例如，人，猴，小鼠，仓鼠或大鼠）、使用覆盖多种终点和物种的体外试验手段评估人相关毒性。使用单一体外细胞测试系统的方法排除了二次遗传毒性的可能，最近的一项研究者开发用于ENM危害预测的先进生理学相关体外技术，使用多细胞型模型以更好地模拟体内环境，，因此增强了对ENM引起的更广泛的潜在损伤的理解和检测的可能性[18]。新的体外模型的策略，如通过三维（3D）生物打印、类器官和芯片上器官培养等技术在器官培养领域取得了很大进展[19]。

3.2 体外毒性研究标准

ENM毒性测试缺乏经过验证的参考标准。当评估常规化学品的毒性时，需要进行阳性和阴性对照，这适用于ENM测试。在纳米医学方面，正在开发的基准ENM，效果仍不理想。建议市场上已有的ENM作为基准/阴性对照或参考标准。此外，细胞毒性测试的结果受ENM的理化性质的影响，在安全性评价时需强调ENM理化性质的鉴定。在开展毒性评价之前，可结合ISO/TR 13014：2012、ISO/TC229等已有的相关标准，仔细判定其理化性能和稳定性[20-22]。ENM分散的程度、分散介质、温度、用于分散的超声能量、分散剂和分散制备步骤的顺序也将影响细胞毒性测试的结果[23]。由于大的表面积，ENM在生理条件下易于聚集。因此，选择合适的载体至关重要。同时，ENM分散/附聚是浓度依赖性现象，其聚集状态时，摄取机制和毒性作用可随剂量非线性地变化。另外，ENM经常与细胞生长培养基相互作用，本身引发毒性反应，其在体内可能具有很少或没有生理相关性。

3.3 细胞摄取和转移实验

除ENM的毒性测试外，摄取、生物分布和浓度也是重要的参数。在进行毒性研究之前，应筛选生物样品中ENM的浓度和摄取量。在体外使用的几种摄取方法。细胞可以在专门插入物（例如Transwells）中的半透膜上生长，放置在组织培养孔中以提供进入顶部和基部隔室的通路。任何形成完整单层并且代表起源器官的贴壁细胞系都可以用作屏障模型。细胞屏障的完整性可以通过测量标记物转移如Lucifer Yellow染料或放射性甘露醇来确定，并结合测量跨上皮/内皮电阻（TEER）[24-25]。通过使用适当的途径抑制剂，可以通过在不同代谢条件下的能量抑制研究来确定转运机制和细胞摄取，例如蔗糖或氯丙嗪（网格蛋白依赖性）与共聚焦或电子显微镜成像相结合[26]。

3.4 细胞毒性实验

不同来源的细胞系，如肠或肺细胞，可以通过估计50%细胞致死浓度的LC值来预测急性毒性。通常主要从细胞ROS生成量、细胞活力、细胞应激情况、细胞形态和细胞的粒子摄取这5个指标进行细胞检测[27]。大多数细胞毒性分析都是基于比色分析，由于染料和ENM之间的相互作用，很容易受到干扰。因此，在对ENM进行这些测试时，为避免出现假阳性或假阴性结果，最常用的方法是乳酸脱氢酶法、四唑仑分析法、中性红分析方法。通过上述分析测量的不同终点代表不同的代谢功能，并且在敏感性方面，这些分析可能存在显著差异。可能最可靠的检测ENM细胞毒性的是增殖检测和克隆检测[28]。

3.5 遗传毒性实验

检测遗传毒性最常用的方法包括细菌艾姆斯试验（Ames试验）、彗星试验和细胞遗传学试验（微核和染色体畸变试验，包括荧光原位杂交和染色体绘制）。Ames试验是组氨酸基因反向突变诱导的调控毒理学中最常用的基因毒性试验，但由于细菌细胞壁和细菌体积小，传统认为Ames试验对ENM试验的适用性不强；彗星试验或单细胞凝胶电泳是EMM遗传毒性试验中最常用的检测方法之一。彗星试验可较为灵敏地检测致断裂剂的作用[29]，有可针对多种脏器/组织开展研究的优势，可结合组织分布研究评价受试物的细胞毒性和遗传毒性。此外，可以结合紫外线辐射测量ENM的光致毒性效应；微核（MN）试验被用于检测细胞毒性效应，也适用于检测各种化合物的基因毒性，包括ENM[30-31]。染色体畸变试验常用于哺乳动物系统的体外和体内，也被用于检测ENM的基因毒性[32-33]。

对于也可用于ENM的化学品的遗传毒性/致突变性试验，经合组织建议进行一系列涵盖广泛遗传毒性终点和物种的体外试验；通常建议进行三种不同的体外试验。如果三个测试中至少有两个是阳性的，那么这种化合物被认为具有基因毒性，也可能致癌。有课题小组提出了新的试验组合优化方案[34]，该方案包含：（ⅰ）Ames试验；（ⅱ）小鼠淋巴瘤tk基因突变试验（一种体外检测致突变剂方法，目前主要被运用于安全性评估，科研领域应用不多，因此使用其开展纳米材料评价的文献很少）；（ⅲ）体外微核试验或体外染色体畸变试验；（ⅳ）体内微核试验或体内染色体畸变或体内彗星试验，假设以上4项试验结果均为阴性，且无潜在致遗传毒性的风险，则可判断该受试物无遗传毒性。如果以上4项试验中至少有一项检测结果显示为阳性，则可判定该受试物存在一定遗传毒性风险，可根据体外检测阳性结果的评价终点，对应进行下一步体内试验，且需要对靶器官(组织)进行仔细研究。具体如图1[34]。

图1 纳米材料遗传毒性试验组合优化方案

3.6 体外致癌毒性

对常规化学品的测试建议将体外转化试验作为第一次筛选的一部分[35]。三种主要的体外转化试验是叙利亚仓鼠胚胎细胞（SHE）、BALB/C 3T3和C3H10T1/2试验。由于SHE试验对基因毒性和非基因毒性化学物质都敏感，并且能够识别90%以上的致癌物，因此它是一种很有前景的试验。体外转化试验正在验证中，已有指导方案也可用。因此，将其中一种分析方法与哺乳动物基因毒性试验一起纳入分级ENM试验策略中，可以有助于ENM的安全性评估。

4 体内毒性实验

除了需经过验证的体外试验方法外，在ENM领域亟需经过验证的体内试验方法。ENM与大分子和其他生物成分的相互作用只能在体内模型中正确探索[8,36-37]。体内研究必须至少进行吸收、分布、代谢和排泄；与细胞、组织和蛋白质的相互作用；荷尔蒙效应和长期的慢性影响等几个方面。另外，确保载体适合ENM的良好分散以避免固有毒性也很重要。研究ENM的药物动力学研究是确定毒性以及设计诊断和治疗的ENM的基础。只有体内的动力学研究才能提供有关靶器官和细胞浓度、血液吸收和体内分布的数据。而尽管呼吸系统和心血管系统是ENM的主要或研究最多的目标，但最近的研究表明，ENM暴露可间接影响其他器官，如ENM与胃肠道相互作用[38-39]。因此，为进一步研究ENM诱导的毒性效应，需要寻找更多的毒性终点。

5 讨论

一方面，确定纳米材料最相关的暴露指标将取决于确定ENM的毒性作用模式的毒理学研究结果以及将不良健康结果与ENM暴露联系起来的流行病学研究。在进行这些研究之前，尤其是毒理学实验，对于哪种暴露指标最合适，将存在不确定性,这需要新的暴露监测技术。另外，开发暴露于ENM的生物标志物将大大增加评估暴露于ENM的潜在风险的确定性。虽然有大量关于几种ENM特异性毒性的详细信息，但由于缺乏ENM毒性的系统数据库，阻碍了ENM生物标志物的开发。这使得ENM的风险和安全评估成为一项挑战，尤其是因为大多数材料缺乏在职业环境或其他环境中暴露于ENM的信息[40-42]。一般而言，评估ENM的效果要求很高，因为ENM特征（物理化学和生物学）的有害作用的关联尚不清楚。为此，需要开发用于预测纳米级材料的新方法[43-44]，目前正在进行一些开发此类危害预测工具和框架的尝试。在计算机模拟模型中，如（定量）结构-效应关系（(quantitative)structure-activity relationships，(Q)SARs）和分组跨读（grouping for read-across）方法也在进一步完善和探索中。

6 小结

ENM的独特特征可能与需要评估的毒性相结合，其引起毒性的主要机制可能是氧化应激、炎症、基因毒性和致癌性，但不排除可能导致心血管、发育和生殖毒性的其他一般特点。需要采用现有的经验证和标准化的体外和体内ENM毒性测试方法进行ENM测试。除适当的测试手段外，测试方案还需要考虑ENM的理化特性、暴露评估以及ENM的吸收和传输，还包括经验证的参考材料和与纳米材料相关的适当控制。