止吐复方纳米乳的制备及其体外透皮性能研究

马天伟，赵子明

(徐州医科大学药学院，江苏 徐州 221004)

半数以上孕妇在妊娠早期会出现早孕反应，包括头晕、嗜睡、食欲缺乏、厌恶油腻、恶心、呕吐等。由于孕妇身体内环境发生变化，危及母婴生命安全[1]。复方止吐纳米乳处方来源于临床验方，其方药包括丁香、半夏、陈皮和生姜。丁香能促进胃液分泌、增强消化能力、减轻恶心呕吐；生姜有增强胃功能的效用；而陈皮、半夏可改善脾脏及人体内环境[2-5]。

纳米乳是一种由表面活性剂、助表面活性剂、油相、水相4个组分组成的透明或半透明的分散系统，粒径为1～100 nm。选择纳米乳作为止吐复方剂型的优势主要在于可以提高止吐复方中难溶性成分的溶解度，减少药物的刺激性；制备工艺技术较简单，制剂质量稳定；纳米乳制剂的分子粒径小，分散度较高，具有良好的膜通透性，有助于药物的透皮吸收[6-11]。

目前该止吐复方的剂型是将药物细粉与赋形剂调成膏状，敷贴使用。该剂型的药物有效成分透皮量与疗效并不理想。本研究在尊重原组方的基础上，采用现代药物制剂新技术制成质量稳定、透皮速率快、生物利用度高的纳米乳制剂，为提高该止吐复方的透皮生物利用度及进一步的新药开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1仪器与试药 RCT basic磁力加热搅拌器(德国IKA公司)，旋转蒸发仪RE-2000A(上海亚荣生化仪器厂)，SB-5200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，NICOMP 380ZLS纳米粒度及Zeta电位检测仪(美国PSS公司)，Primaide型高效液相色谱仪(日本日立公司)，RYJ-6B型药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器有限公司)，PHS-3E型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

止吐复方粉末(徐州市妇幼保健院)，丁香酚标准品(纯度≥98%，合肥博美生物科技有限公司生产，批号：BZP0074)，卡必醇(纯度99%，山东优索化工科技有限公司生产，批号：049601001100)，薄荷油(食品级，山东优索化工科技有限公司生产，批号：049903001100)，肉豆蔻酸异丙酯(isopropyl myristate，IPM)(纯度99%，山东优索化工科技有限公司生产，批号：049903001100)，聚乙二醇-40氢化蓖麻油(polyethylene glycol-40 hydrogenated castor oil，RH40)(纯度99%，山东优索化工科技有限公司生产，批号：059212010090)，乳化剂聚氧乙烯辛基苯酚醚-10(polyoxyethylene octylphenol ether，OP-10)(纯度99%，山东优索化工科技有限公司生产，批号：059102007100)，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)400(纯度99%，山东优索化工科技有限公司生产，批号：059701011160)，橄榄油(食品级，山东优索化工科技有限公司生产，批号：069905014030)，油酸(纯度99%，山东优索化工科技有限公司，批号：049896001111)，1,2-丙二醇(食品级，山东优索化工科技有限公司，批号：069803001430)，鲸蜡硬脂醇聚氧乙烯醚20(平平加O-20)(纯度99%，山东优索化工科技有限公司生产，批号：039299001030)，其余试剂为分析纯。

健康雌性清洁级小鼠30只，来自徐州医科大学实验动物中心。实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2015-0009。

1.2止吐复方纳米乳的制备工艺研究

1.2.1止吐复方提取物的制备 按照已确定的工艺制备止吐复方提取物：称取适量止吐复方中药粉末，以70%乙醇为提取溶剂，按料液比1∶10加入，70 ℃回流提取2次，每次1.5 h；提取液放入4 ℃的冰箱静置12 h，减压过滤，滤液于旋转蒸发仪上45 ℃浓缩至原体积的1/5，浓缩液冷冻干燥得止吐复方提取物。

1.2.2止吐复方纳米乳的制备方法 精密称取适量油相与止吐复方提取物，置磁力搅拌器上搅拌均匀，按一定质量比精密称取适量表面活性剂和助表面活性剂加入混合液中搅拌均匀，然后边搅拌边向混合体系中缓慢滴加水相，直至形成澄清透明、流动性好的纳米乳。

1.2.3处方的筛选 油相的筛选：在预实验基础上，在IPM、薄荷油、橄榄油、油酸中进行筛选。乳化剂的筛选：在预实验的基础上，本研究在RH40、OP-10、平平加O-20等表面活性剂中进行筛选。助乳化剂的筛选：为了形成更小的纳米乳乳滴，用助乳化剂可调节乳化剂的亲水亲油平衡值(hydrophile-lipophile balance，HLB)值。本实验在PEG400、1,2-丙二醇、卡必醇中进行筛选。

1.2.4伪三元相图的绘制 精密称取适量油相与止吐复方提取物，置磁力搅拌器上搅拌均匀，按乳化剂与助乳化剂的质量比(Km值)为 1∶1、2∶1、3∶1均匀混合制成4种混合乳化剂，然后按照质量比为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例精密称取一定量的混合乳化剂加入混合液中搅拌均匀，然后边搅拌边向混合体系中缓慢滴加水相，详细记录各种状态变化时的耗水量，计算油相、水相、混合乳化剂所占的质量分数(w/w)。根据油、水、混合乳化剂在临界点的质量分数，采用Origin 9.0绘制伪三元相图，确定形成纳米乳的区域，形成纳米乳的区域越大，纳米乳越稳定。

1.3止吐复方纳米乳的理化性质与稳定性考察 取不同批次纳米乳样品，采用pH计测定其pH值，用旋转黏度计测定其黏度，用激光粒度分析仪测定其粒径分布与zeta电位。

将止吐复方纳米乳以13 000×g速度离心20 min，观察纳米乳是否出现沉淀、分层。浑浊等外观现象[12]。

1.4止吐复方中丁香酚含量的体外测定方法研究

1.4.1高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)色谱条件色谱柱：WondaSil C18 WR(4.6 mm×25 cm，5 μm)；流动相：甲醇-0.01%三氟乙酸(65∶35)；流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

1.4.2标准曲线的建立 精密称取丁香酚标准品5 mg，甲醇溶解并定容至50 mL，制成100 μg/mL丁香酚标准溶液。然后用甲醇稀释该溶液，制成浓度分别为1、2、5、10、20、50 μg/mL的对照品溶液，每个浓度分别吸取20 μL进样，测得峰面积。以浓度对峰面积进行线性回归，即得标准曲线方程。

1.4.3专属性实验 取制备好的止吐复方纳米乳5 mL置于50 mL量瓶中，加入30 mL甲醇破乳，超声10 min，用甲醇稀释至刻度，过0.22 μm微孔滤膜得止吐复方样品溶液。取空白纳米乳5 mL置于50 mL量瓶中加入30 mL甲醇破乳，超声10 min，用甲醇稀释至刻度，过0.22 μm微孔滤膜得空白纳米乳溶液。

按照标题1.4.1的色谱条件，分别测定止吐复方样品溶液与空白纳米乳溶液，分析该检测条件的专属性。

1.4.4稳定性考察 精密称取丁香酚标准品，配成 50 μg/mL标准溶液，于 0、1、2、4、6、8 h进样测定，记录峰面积值。

1.4.5日内、日间精密度实验 精密度实验：取2、5、10 μg/mL的丁香酚对照品，分别于日内0、6、12 h和日间1、2、3 d测定其峰面积，根据标准曲线计算实测浓度和相对标准差(RSD%)。

1.5体外透皮实验 取健康小鼠30只，涂抹脱毛膏，刮去腹部毛发，温水洗净，静养1 d后用颈椎脱位法处死，立即剥离腹部皮肤，去除脂肪及皮下组织，用0.9%氯化钠溶液洗净，放入2～8 ℃冰箱中备用。

采用Franz扩散池，有效渗透面积为2.27 cm2，接收介质为含25%无水乙醇的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，接收池体积为8 mL。分别取止吐复方纳米乳 1 mL与止吐复方原剂型膏状物0.1 g置于供给池中，在(37±1)℃、300 r/min搅拌条件下进行实验，分别于1、2、4、6、8 h取出1 mL接收液(同时补充同温等量接收介质)，13 000×g离心10 min，取上清液，HPLC测定。计算单位面积累积经皮渗透量Qn和累积渗透百分率P。Qn=(CnVn+∑CiVi)/A；P=Qn/Qs×100%。公式中Cn为第n个取样点药物的校正浓度，Ci是第i个取样点测得的药物浓度，Vn和 Vi分别是接收池的体积(8 mL)和取样体积(1 mL)，A是扩散池的扩散面积(A=2.27 cm2)，Qs是供给池中丁香酚质量。体外透皮实验按不同处方分组，混合乳化剂/油相=9∶1,7.5∶1,6∶1；B∶Km=3∶1,2∶1,1∶1；C：油相为薄荷油与IPM。其中平行操作次数为3次。

2 结 果

2.1止吐复方纳米乳的制备工艺研究

2.1.1油相的初步筛选 油酸和橄榄油溶解止吐复方提取物时无法形成透明的液体，而是变得浑浊或分层，故排除这两种油相。IPM和薄荷油对止吐复方提取物均有较好的溶解性能，故初步确定以IPM和薄荷油为纳米乳油相的选择。

2.1.2乳化剂的筛选 绘制油相为IPM，助表面活性剂为卡比醇，Km值为2∶1时，乳化剂分别为RH40、OP-10、平平加O-20的伪三元相图，见图1。以RH40、OP-10、平平加O-20为乳剂均能形成纳米乳，其中以RH40所形成的纳米乳区域最大，故选择RH40作为纳米乳的表面活性剂。

2.1.3助乳化剂的筛选 绘制油相为IPM，表面活性剂为RH40，Km为2∶1时，助表面活性剂分别为卡比醇、1,2-丙二醇、PEG400的伪三元相图，见图2。以卡必醇、1,2-丙二醇、PEG400为助表面活性剂均能形成纳米乳，其中以卡必醇所形成的纳米乳区域最大，故选择卡必醇作为纳米乳的助乳化剂。

2.1.4Km值的筛选 绘制油相为IPM，乳化剂为RH40，助乳化剂为卡比醇，乳化剂与助乳化剂的比例Km值分别为1∶1、2∶1、3∶1时的伪三元相图，见图3。在RH40-卡比醇-IPM混合油-水体系中，当Km为2∶1时所形成的纳米乳区域最大，故确定Km=2∶1。

1A：RH40(聚乙二醇-40氢化蓖麻油)；1B：OP-10(聚氧乙烯辛基苯酚醚-10)；1C：平平加O-20(鲸蜡硬脂醇聚氧乙烯醚20)

图1 乳化剂对纳米乳区域的影响

2.1.5油相的进一步筛选 绘制乳化剂为RH40，助乳化剂为卡比醇，Km=2∶1时，油相分别为IPM和薄荷油的伪三元相图，见图4。当乳化剂为RH40、助乳化剂为卡比醇、Km=2∶1时，油相为薄荷油形成的纳米乳区域面积大于IPM形成的纳米乳区域面积。同时，油相为薄荷油的纳米乳热力学稳定性优于油相为IPM的纳米乳。因此，选择薄荷油作为止吐复方纳米乳的油相。伪三元相图确定的优化处方将通过体外透皮实验来进一步验证。

2.2止吐复方纳米乳的理化性质与稳定性考察 止吐复方纳米乳的pH值为6.3±0.2，处于人体皮肤pH范围内，刺激性小；止吐复方纳米乳的黏度为(5.18±0.13)mPa·s，具有比水更高的黏度；止吐复方纳米乳的粒径为(26.5±5.6)nm，符合纳米乳的粒径范围；zeta电位为-0.73±0.24，接近中性。高速离心实验表明，本研究制备的止吐复方纳米乳在13 000×g离心20 min，纳米乳仍为淡褐色透明均一体系，未出现沉淀、分层、浑浊等现象。

2.3止吐复方中丁香酚含量的体外测定方法研究 标准曲线方程为：A=75 665.2C+3 549.2，r=0.998,P<0.01，线性范围为1～50 μg/mL。纳米乳成分对丁香酚的测定无干扰(图5)。稳定性考察的RSD 值为1.42%。HPLC法测定的日内精密度分别为0.40%、0.37%、0.82%，日间精密度分别为1.42%、1.84%、1.88%。

2.4体外透皮实验 当纳米乳中混合乳化剂使用比例增加时，纳米乳的透皮效果会随之增加(图6A)；Km=2∶1和3∶1时累积透皮吸收率比较差异无统计学意义(P>0.05)，但均显著优于Km=1∶1的纳米乳(P<0.05)(图6B)；薄荷油作为油相的止吐复方纳米乳的透皮吸收优于IPM(P<0.05)(图6C)。

3 讨 论

非离子型表面活性剂的毒性和刺激性较小，pH等外界因素对其影响较小，常被用于纳米乳的制备。制备O/W型纳米乳的乳化剂的HLB值为8～18[13]。本研究选用的3种非离子表面活性剂RH-40(HLB=13～14)、OP-10(HLB=14.5)、平平加0-20(HLB=16.5)均在此范围内。其中RH-40与OP-10 形成的纳米乳区域较大，可能是由于两者的HLB值与所用的油相IPM所需的HLB值(12.0)更匹配，乳化效果好。研究发现，只有乳化剂参与形成的纳米乳不够稳定，需要助乳化剂的参与才能使纳米乳更加稳定[14]。王晶等[15]以RH40为乳化剂，Labrafil M1994 CS为油相，Km为2∶1时，比较了乙醇、丙二醇、正丁醇作为助乳化剂的伪三元相图，发现醇的亲脂性越强，伪三元相图中的纳米乳区域面积越大。本研究中卡必醇作为助乳化剂优于1,2-丙二醇和PEG400,这可能是由于卡必醇既溶于水，又具有一定的亲脂性，提高了界面膜的柔顺性和牢固性，降低了体系的黏度，有助于O/W型纳米乳的形成。混合乳化剂中乳化剂和助乳化剂在最适宜的比例中才能使形成的界膜既有一定的刚性，也有一定的柔性。本研究中，Km=1∶1时，乳化剂用量较少，乳化能力较弱，纳米乳区域较小；Km=2∶1时，两者的配比达到最佳状态，助乳化剂较好地镶嵌在乳化剂中有利于纳米乳的稳定；如乳化剂的量继续增加，助乳化剂的量相对减少，也无法实现最佳乳化效果。体外透皮实验的皮肤模型通常是用动物皮肤代替人的皮肤来进行。虽然乳猪和猴子皮肤对某些药物的透过性能与人皮肤相似，但因为来源不易，未得到推广。目前使用较多的是4～7周龄的小鼠皮肤，其与人皮肤结构基本一致，且毛孔密度较接近，也容易获得[16-17]。接收液会影响药物的稳态累积渗透速率[18]，因此在实验过程中接收液的选择至关重要。有效成分透过鼠皮后应能完全溶解于接收液，并且其在接收液中的浓度远小于该成分的饱和浓度才能促使有效成分不断透过皮肤。止吐复方提取物中脂溶性成分较多，因此需加入一些醇类或其他非离子表面活性剂以提高其溶解度[19-20]。本研究考察了含5%～30%乙醇的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)对脂溶性指标成分丁香酚的溶解度，发现含25%乙醇的磷酸盐缓冲液可以满足漏槽条件，因此采用含25%乙醇的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)溶液作为接收介质。

2A：卡必醇；2B：1,2-丙二醇；2C：PEG(聚乙二醇)400

3A：Km=3∶1；3B：Km=2∶1；3C：Km=1∶1

4A：IPM(肉豆蔻酸异丙酯)；4B：薄荷油

5A：空白纳米乳；5B：丁香酚标准品；5C：止吐复方纳米乳

6A：混合乳化剂/油相=9∶1,7.5∶1,6∶1；6B：Km=3∶1,2∶1,1∶1；6C：油相为薄荷油和IPM；*8 h时混合乳化剂/油相=9∶1与混合乳化剂/油相=7.5∶1比较，P<0.05；#8 h时混合乳化剂/油相=9∶1与混合乳化剂/油相=6∶1组比较，P<0.05；△8 h时Km=2∶1组与Km=1∶1组比较，P<0.05；▲8 h时薄荷油组与IPM组比较，P<0.05

图6 不同处方纳米乳透皮试验结果

透皮实验结果显示，当纳米乳中混合乳化剂使用比例增加时，纳米乳的透皮效果会随之增加。这是由于乳化剂/助乳化剂能够短暂打开皮肤屏障的紧密连接，具有良好的促进渗透作用，但随着其用量的增加，也可能产生一定的刺激性，故需在保证安全性的前提下优化混合乳化剂用量。Km=2∶1和3∶1的透皮效果优于Km=1∶1，表明在混合乳化剂中主乳化剂对增加透皮吸收发挥更关键的作用。本研究中薄荷油为油相的透皮转运效果强于IPM，可能由于薄荷油本身就是一种透皮吸收促进剂，利于药物透过细胞间隙透皮扩散[21]。

综上所述，结合伪三元相图与体外透皮吸收的结果，本研究确定的止吐复方纳米乳最佳处方为油相采用薄荷油，乳化剂采用RH40，助乳化剂采用卡比醇，Km=3∶1，混合乳化剂与油相的比例为9∶1。采用该处方制备的止吐复方纳米乳制剂的体外透皮效果相比原剂型有了显著的增强，为该类型中药复方制剂的新型透皮给药系统研发提供了新思路。