多重耐药铜绿假单胞菌联合药敏分析

刘春都,朱叶飞

(1.南京医科大学第二附属医院检验医学中心,南京 210011；2.南京市浦口医院检验科,南京 210031)

铜绿假单胞菌是院内感染最常见的条件致病菌之一[1],特别是近年来随着广谱抗菌药物过度应用，以及各种侵袭性、损伤性诊断、治疗手段的使用，铜绿假单胞菌的耐药率不断升高[2]，对临床常用的抗菌药物敏感性逐渐降低，出现了对3种或以上抗菌药物同时耐药的铜绿假单胞菌菌株，即多重耐药铜绿假单胞菌(multiple drug resistant Pseudomonas aeruginosa,MDR-PA)。据专家共识[3]，一些常规、单一的抗菌药物对MDR-PA几乎没有效果，临床上往往需要采用联合用药的方式对MDR-PA进行有效治疗，这就需要选择有效的药物联合方式。中华医学会呼吸病学分会感染学组于2014年发布的铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识[3]指出：对感染严重的患者必须采用联合用药的方案，充分发挥联合药物之间的协同和相加效应来增强抗菌效应，以便对MDR-PA进行有效治疗。本研究通过体外药物敏感试验来选择对MDR-PA敏感的联合药物，以对临床MDR-PA感染进行有效的治疗。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2015年1月至2017年12月南京市浦口医院细菌室分离保存的全部32株MDR-PA，所有菌株均按医院微生物实验室操作规程的要求分离、培养，并经VITEK-60微生物仪鉴定，纸片扩散法(K-B法)确认，筛选出MDR-PA。其中男18例、女14例，年龄48～89岁，标本来自南京市浦口医院住院患者的痰液、血液和尿液等，同一患者相同部位分离的菌株不重复计算。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853，购自国家卫生健康委员会临床检验中心。

1.2仪器、试剂和药物 VITEK-60微生物鉴定仪及其配套的鉴定卡和药敏卡，以及麦氏标准比浊仪购自法国生物梅里埃公司，接种仪、96孔平板、M-H琼脂平板和哥伦比亚血琼脂平板购自浙江拱东医疗科技有限公司，净化工作台、电热恒温孵育箱和细胞培养箱购自安徽中科都菱商用电器公司，所有药敏纸片和药敏试剂购自法国生物梅里埃公司。

1.3菌株复溶、培养、鉴定、配制菌液，筛选出MDR菌株 将超低温冰箱保存的菌株复溶、培养、鉴定并挑取已经分离纯化的2～3个菌落于0.9% NaCl注射液中，将菌液稀释成0.5麦氏标准单位备用，并采用K-B法筛选出MDR-PA,即对不少于3种常规抗菌药物耐药的菌株为MDR[3]。

1.4联合药敏试验 依据中华医学会铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识[4-5]，选择替卡西林/克拉维酸+氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦+环丙沙星、美罗培兰+环丙沙星、依替米星+哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶+阿米卡星、多黏菌素E+环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦+左氧氟沙星、头孢吡肟+环丙沙星共8组药物联合，采用微量棋盘稀释法，以各单药MIC的2倍为最高浓度，依次倍比稀释8个稀释浓度，取配伍的两种稀释药物各50 μL加入平板孔中，再加入100 μL稀释后的菌液于各孔中，使菌液浓度为5×105CFU/mL。以铜绿假单胞菌ATCC27853为质控菌株，单用的每种抗菌药物做3个复孔，联用的每组药物也做3个复孔，分别测定MIC值，以每种(或每组)药物所得的3个MIC值的中间值为该种抗菌药物的最终MIC值。

1.5部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration，FIC)指数计算和判读标准 FIC指数=甲药联用/甲药单用+乙药联用/乙药单用，依据指数判断标准FIC指数≤0.5、0.52.0，分别表示为协同、相加、无关和拮抗[6-8]。

2 结 果

2.1MDR-PA的年份变化 收集南京市浦口医院细菌室2015—2017年分离培养和鉴定的32株MDR-PA，其中2015年9株、2016年11株、2017年12株。

2.2MDR-PA样本来源 32株MDR-PA中，痰液14株，占43.8%；尿液6株，占18.8%；血液5株，占15.6%；脓液4株，占12.5%；其他样本3株，占9.4%，见表1。

表1 2015—2017年32株MDR-PA样本来源 (株)

MDR-PA:多重耐药铜绿假单胞菌

2.3MDR-PA科室分布 32株MDR-PA自于ICU 10株，占31.3%；其次分别是肿瘤科7株,占21.9%、呼吸内科5株,占15.6%，老年科6株,占18.8%，其他科室4株,占12.5%。见表2。

表2 2015—2017年32株MDR-PA科室分布 (株数)

MDR-PA:多重耐药铜绿假单胞菌

2.4MIC值及其比较 在本试验的8组配对药物中，只有头孢吡肟与环丙沙星联用的MIC值在联用前后相同，头孢吡肟在单用时MIC值为16 μg/mL，与环丙沙星联用后，MIC值仍为16 μg/mL，没有变化；在这组药物中，另一种药物环丙沙星也是单用与联用时MIC值均为8 μg/mL，也没有变化。其余7组联用药物中，各组每种药联合与单独使用时MIC值均下降明显。如替卡西林/克拉维酸与氨曲南的MIC值均从单用的64 μg/mL下降到16 μg/mL，其余每组的情况见表3。

表3 8组配对药物联合与单独时对MDR-PA的MIC值 (μg/mL)

MDR-PA:多重耐药铜绿假单胞菌；*每组联合药物联用时，采用棋盘稀释法得这两种药物最佳抑菌浓度比作为联合使用时各自的MIC

2.58组联合药物对32株MDR-PA的药物效应构成比 在这8组药物中，只有头孢吡肟与环丙沙星联用这组，药物效应表现为无关时的构成比占71.9%，即这组药物联用时对试验的32株MDR-PA有23株表现为拮抗作用。其余7组联用药物，药物效应表现是协同与相加效应的占85%以上。8组联合药物对32株MDR-PA的药物效应构成见表4。

表4 8组联用药物药学效应的构成比 [株(%)]

TCC：替卡西林/克拉维酸；ATM:氨曲南；TZP:哌拉西林/他唑巴坦；CIP:环丙沙星；MEM:美罗培南；ETM:依替米星；AKN:头孢他啶；CAZ:阿米卡星；COL：多黏菌素E；SCF头孢哌酮/舒巴坦；LVX:左氧氟沙星；FEP:头孢吡肟

3 讨 论

铜绿假单胞菌是院内感染最常见的革兰阴性菌，随着抗菌药物的滥用，铜绿假单胞菌的耐药率不断升高，并出现MDR-PA[9]。2015—2017年南京市浦口医院共分离出32株MDR-PA，2015—2017年分别是9株、11株和12株，呈逐年上升趋势。

南京市浦口医院分离的MDR-PA主要来自呼吸道样本，与2017年中国细菌耐药监测网显示的结果一致[10]。本研究约85%的MDR-PA来自呼吸道分泌物、尿液、血液、伤口脓液等标本；主要分布在ICU、肿瘤科和老年科等临床科室，主要原因是这些科室患者免疫力差，机械性或侵入性诊疗多，细菌感染的机会多。MDR-PA主要通过钝化酶或灭活酶、β-内酰胺酶类抗菌药物作用靶位-青霉素结合靶位的改变、生物膜的形成、外膜孔道蛋白通透性降低、从外界获得耐药基因、外排系统的过度表达等方式获得耐药性[11-12]。每株MDR-PA的耐药性往往是几种耐药机制综合作用的结果，因此要找到对这株MDR-PA有效的药物，一是研制针对这种细菌新的药物；二是通过药敏试验找到敏感的药物抑制或杀灭MDR-PA，从而达到治疗的目的[13]。

MDR-PA对单一抗菌药物疗效差，多主张联合用药[14]。但联合用药不是任意两种抗菌药物的运用，不合理的运用可减少抗菌药的抗菌活性，甚至发生中毒、二重感染等严重后果[15]，所以必须符合联合用药指征：在严重感染而又必须立即进行抗菌治疗时可联合用药，以扩大抗菌范围；对单一用药无效的严重感染；长期单一用药易发生耐药时；联合用药可降低单一用药剂量，从而减少不良反应时，可考虑联合用药[16-17]。

本研究8组联合药物中，除多黏菌素E与环丙沙星以及替卡西林/克拉维酸与氨曲南外，其余6组均是β-内酰胺抗菌药物与氨基糖苷类或氟喹诺酮类联合运用。依据专家共识，对MDR-PA采用了8组药物联合，其中替卡西林/克拉维酸、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦在与各自配对药物使用前后的MIC值联用是单用的1/4；环丙沙星、依替米星、头孢他啶、多黏菌素E、左氧氟沙星的MIC值联用是单用的1/2；但头孢吡肟与环丙沙星联用时，MIC值在联用前后保持不变。在选用的8组配对药物中，未出现MIC值增加的情况(即配对组合的两种药物联用后，抗菌效应降低)，绝大多数(8组配对药物中，有7组)配对药物组合的MIC值有明显降低，说明对MDR-PA的感染，联合用药能够取得比单一用药更好的效果[15]。从作用机制上分析，β-内酰胺类抗生素主要是作用于细胞膜上的青霉素结合靶位，造成细胞壁的破坏而发挥杀菌作用。氨基糖苷类虽然具有耳、肾毒性作用限制了其在临床上的广泛应用，但联合用药时用量减少，从而降低毒性作用，因此在临床上可以推广应用。据2016年中国细菌耐药监测网可知，多黏菌素和阿米卡星是常用的对铜绿假单胞菌耐药率最低的两种抗菌药物，耐药率分别为0.9%、6.1%，而氨曲南的耐药率达到了31.4%，当与替卡西林/克拉维酸配对联合运用后，MIC值从64 μg/mL下降到16 μg/mL[16]。这是因为替卡西林/克拉维酸与氨曲南配对运用后既对β-内酰胺酶稳定又对金属酶稳定，因此不易被分解而发挥抗菌作用[18-19]。多黏菌素E由于具有肝、肾以及神经毒性作用，临床应用受限，但当多黏菌素E与环丙沙星联合用药时可以减少用量，使毒性作用降低，这就满足了在临床上应用的要求[20]。头孢吡肟与环丙沙星联合运用后MIC值无变化，而单独使用时均具有较强的抗铜绿假单胞菌活性，耐药率低(头孢吡肟耐药率为18.7%、环丙沙星为6.1%)，原因可能是头孢吡肟与环丙沙星联合使用时，与MDR-PA相应靶位的结合能力受到影响，导致药物敏感性下降。因此，临床上在选择有效抗菌药物时，药敏试验是一个必要的途径，通过选择对治疗MDR-PA感染有效的药物组合，可以避免滥用抗生素造成的耐药率不断升高以及医疗资源的浪费。

药物之间的相互作用从药效学上分为协同、相加、无关和拮抗4种，通过计算FIC指数可以评价药物联合所产生的效应，本研究的8组配对药物中有7组联合药物每组的两种药物之间药效学主要表现为协同和相加作用，当这两种药物联合使用时就会对单一药物难治的MDR-PA感染有效。而头孢吡肟与环丙沙星联合组的两种药物之间药效主要表现为无关作用(占71.9%)，因此在临床上尽量避免使用。

总之，通过联合药敏试验选择有效的药物联合抑制或杀灭MDR-PA是临床治疗MDR-PA感染的有效方案，避免无关及拮抗药学效应的联合药物在临床上的使用。