lncRNA在动脉粥样硬化病变中的作用研究进展

张丽娜，姚德山，沈 慧，龚开政,2※

(1.扬州大学附属医院心血管内科，江苏 扬州 225001；2.扬州大学心血管研究所，江苏 扬州 225001)

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要致病和死亡原因[1]。实验研究已经确定了动脉粥样硬化的几个危险因素，包括高血压、血脂异常、糖尿病、肥胖、吸烟、饮食、性别等[2]。动脉粥样硬化的发生在一定程度上与内皮细胞功能紊乱和慢性炎症密切相关。长期以来，人们一直关注那些能转录、编码、翻译蛋白的各种基因序列，这类哺乳动物基因组中蛋白质编码基因的比例不足2%，但随着二代测序的发展，发现剩下的非蛋白编码区并非“垃圾DNA”，而是包含大量转录调控元件和非编码RNA基因，且这些非编码RNA在生物学过程中起着非常重要的作用，目前发现或预测的人非编码基因已经超过了蛋白质编码基因，达到4万以上，其中主要为长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)[3]。lncRNAs是一类高度保守的序列，它们通常具有多种功能，主要包括信号转导、分子诱饵、支架和引导核糖核酸复合体等。研究表明，lncRNAs可参与调节巨噬细胞、内皮细胞、血管炎症和新陈代谢的功能，因此lncRNAs可能在动脉粥样硬化的进展中具有重要的影响[4]。最近，基因组学研究揭示了一系列新的lncRNAs候选生物标志物可能有助于对动脉粥样硬化发病机制的深入研究，现就lncRNAs在动脉粥样硬化病变中的作用研究进展予以综述。

1 lncRNAs的特性与功能

lncRNAs是继微RNAs(microRNAs，miRNAs)之后的研究热点。目前，将核苷酸长度>200 nt，无蛋白编码功能的RNA定义为lncRNAs[5]。2015年，StLaurent等[6]依据lncRNAs的大小、来源及基因组定位，将其主要分为正义、反义、基因内、基因间、双向 lncRNA和环状RNA六类。最近的研究发现，lncRNAs在多种通路中均起到了关键的作用，主要功能包括：①基因印迹：基因印迹为表达调控的一种，能够使2个等位基因中1个表达1个不表达(父源或母源基因)，X染色体失活特异性转录物是首个被发现在基因印迹中起重要作用的lncRNA；②分子诱饵：lncRNA可诱导蛋白质与其结合，从而抑制下游基因的表达；③支架或向导功能：lncRNA的支架和导向功能是目前的研究热点，lncRNA可与蛋白质或DNA结合，将特定复合物引导到相应的位置上；④信号功能：当细胞受到某种刺激后可表现出相应的组织特异性，可成为疾病的生物学标志物[7]。虽然，目前大多数研究仍处于初级阶段，希望通过对lncRNAs与动脉粥样硬化疾病之间关系的深入探讨和总结，为日后的研究奠定基础，并为动脉粥样硬化引起的心脑血管疾病提供新的诊疗思路。

2 lncRNAs在巨噬细胞和炎症中的作用

内皮功能受损是早期动脉粥样硬化发生的病理特征性改变之一，主要发展方式为内皮损伤刺激了单核细胞向血管壁迁移，从而损伤血管内皮进一步激活巨噬细胞，激活的巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞，又经过正反馈作用致使更多的巨噬细胞聚集，最终导致血管管腔狭窄以及粥样斑块破裂而发生急性缺血事件。由此可见，巨噬细胞在脂质和炎症的联系中起到了关键性的作用。有研究表明，巨噬细胞可通过自噬作用抑制炎症反应，从而减少不稳定斑块的发生，异常自噬与多种心血管疾病相关[8]。lncRNA可作为基因调控的新因素。Wang等[9]报告了一种被称为自噬促进因子的lncRNA，其通过靶向调控miR-188-3p和自噬相关基因(autophagy-related gene，ATG)7来调节自噬细胞的死亡；同时发现自噬促进因子lncRNA通过调节miR-188-3p，影响ATG7的表达、自噬细胞的死亡以及心肌梗死，从而提出了由自噬促进因子lncRNA、miR-188-3p和ATG7所组成的自噬调控模式，此模式在分子水平调节中的作用可能成为心肌梗死和心力衰竭新治疗策略中的潜在靶点和诊断工具。此外，lncRNAs也是哺乳动物发育中的重要调节因子。Chen等[10]研究发现，与miR-199a-5p共同调节人单核细胞/巨噬细胞分化的长链非编码单核细胞RNA(long noncoding monocytic RNA，lncRNA-MC)亦不可或缺，lncRNA-MC单核巨噬细胞和人急性早幼粒白血病细胞以及CD34+造血干/祖细胞向单核/巨噬细胞分化过程中表现出增加的趋势，且能被PU.1转录激活；这一研究表明，lncRNA-MC和miR-199a-5p在单核细胞/巨噬细胞分化中具有相反的作用，其中，lncRNA-MC在单核细胞/巨噬细胞的分化过程起促进作用，通过吸收miR-199a-5p并释放ⅠB型激活素受体的表达增强pu.1的作用。另外，在一项针对冠心病患者和健康人血液样本的分子标志物筛选研究中发现，CoroMarker独立于已知的冠心病危险因素和其他心血管疾病，可成为最佳候选生物标志物；进一步的前瞻性研究发现，CoroMarker的灵敏度和特异度分别为76%和92.5%；功能富集分析显示，CoroMarker与信号转导、跨膜转运、突触传递及先天免疫呈正相关的基因聚集在一起，与炎症呈负相关；而采用CoroMarker 小干扰RNA处理降低了培养基中促炎细胞因子(白细胞介素-1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α)的浓度，这一结果进一步证明了分布于循环血的囊泡和单核细胞中的CoroMarker可能作为诊断冠状动脉粥样硬化的重要指标[11]。也有研究人员用深度RNA测序法组装人单核细胞来源的巨噬细胞的lncRNAs转录组，并通过不同的处理方式激活巨噬细胞，结果发现了巨噬细胞的活化，尤其是M1表型巨噬细胞的活化可显著改变lncRNAs的表达谱，提示了lncRNAs在调节巨噬细胞炎症功能中的潜在作用，为lncRNAs在动脉粥样硬化的炎症和巨噬细胞中的研究奠定了基础[12]。

3 lncRNAs在内皮功能调节中的作用

内皮细胞是人体内重要的分泌器官和靶器官，在维持内环境稳态和心血管疾病的发病过程中发挥着极其重要的作用。而lncRNAs可以通过介导内皮细胞的各个环节，从而参与动脉粥样硬化斑块的发生发展。最近，在人类脐静脉内皮细胞和人类皮肤微血管内皮细胞中，科学家使用1个lncRNAs微阵列芯片识别出了116种富含内皮细胞的lncRNAs，其中包括HHIP-AS1、FLI-AS1、LOC100505812/CARD8-AS、aAF161442/HSPC324和STEEL[13]，这些基因的发现证明lncRNA参与内皮细胞的调节过程。另有研究发现，lncRNA转化生长因子-β2重叠转录本1能与miR-3960、miR-4488和miR-4459结合，靶向调控神经酰胺合成酶1/N-乙酰转移酶8类和La-核糖核蛋白结构域家族成员1的表达，从而参与内皮细胞的自噬和免疫反应[14]。此外，lncRNA-p21通过与miR130b的结合以调控血管内皮细胞生长来证明自身的独特地位[15]。而lncRNA心肌梗死相关转录物(myocardial infarction associated transcript，MIAT)可通过参与miR-150-5p和血管内皮生长因子的相互作用调节内皮细胞的功能。Yan等[16]研究表明，剔除MIAT可显著改善糖尿病诱导的视网膜微血管功能障碍，抑制内皮细胞增殖、迁移和血管形成。MIAT作为竞争性内源性RNA发挥作用，并与血管内皮生长因子和miR-150-5p形成一个负反馈来调节内皮细胞的功能。lncRNA MIAT在改善糖尿病所致的肾脏微循环障碍中的关键作用，再次证明了lncRNAs在病理性血管生成中的作用，推动了lncRNAs在血管疾病中靶向诊断和治疗的进展。此外，Lu等[17]利用微阵列分析发现了1个新的lncRNA位点100129973，它作为一种凋亡抑制剂，能通过海绵miR-4707-5p、miR-4767和lncRNA100129973上调凋亡抑制因子5和BCL2L12的表达，以减少细胞凋亡。这一证据表明，lncRNA100129973在改善内皮功能和治疗凋亡相关心血管疾病中是一个极具吸引力的靶点。Wang等[18]报道，氯吡格雷可通过抑制lncRNA缺氧诱导因子1α-反义RNA 1来抑制棕榈酸诱导的人血管内皮细胞凋亡和增殖，这一结果为氯吡格雷治疗心血管疾病提供了一种新的作用机制，也证明了lncRNA缺氧诱导因子1-α-反义RNA 1在心血管疾病的发病机制中发挥着重要作用。科学家利用基因芯片、RNA干扰、RNA芯片分析、生物信息学、荧光素酶报告分析等技术发现，3-Benzyl-5-[(2-nitrophenoxy)methyl]-dihydrofuran-2(3H)-one(3BDO)作为一种新的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶激活剂，自噬抑制剂，显著降低了来源于转化生长因子-β2的3′非翻译区lncRNA-FLJ11812的水平；3BDO通过FLJ11812与以ATG13为靶点的miR-4459结合降低了ATG13蛋白水平，这表明lncRNAs在心血管疾病自噬中的作用主要是通过与内皮细胞自噬作用相互竞争得以实现的[19]。lncRNAs在人类基因组过程中具有调节作用，但在血管老化中的作用仍存在许多未知。在人类的动脉粥样硬化斑块中H19主要由内皮细胞表达，与从健康人的颈动脉取得的活检相比，动脉粥样硬化中的H19明显减少，就这一发现，Hofmann等[20]建立了内皮特异性诱导的H19缺陷小鼠，通过一系列的实验方法证明了lncRNA H19 的功能缺失不仅可以导致p16和p21上调、诱导增殖减少和衰老增加，而且可以诱导信号转导及转录激活因子3磷酸化而发挥作用；且H19的缺失可以降低内皮细胞的功能，而H19的过表达改善了主动脉的内皮功能，表明lncRNA H19在控制内皮细胞老化方面具有关键作用。

4 lncRNAs在血管平滑肌调节中的作用

血管功能失衡是导致动脉粥样硬化、高血压和肺动脉高压的主要原因，血管损伤、血管重构以及血管生成是冠状动脉粥样硬化疾病和脑血管疾病的主要病理过程。目前，血管平滑肌突变学说已经得到广泛的共识，许多非编码RNAs(如miRNAs和lncRNAs)参与了血管平滑肌细胞行为的调控也已被广泛接受。Song等[21]通过回顾分析，确定了部分非编码RNAs在血管损伤和重构过程中动态调控作用；阐述了miRNAs和lncRNAs在血管损伤、血管重构以及血管生成中的分子机制、临床与诊断意义的研究进展；强调了miRNAs和lncRNAs在血管疾病中的重要作用。通过全基因组关联分析发现，lncRNAs与冠状动脉疾病遗传易感性之间的关系不容忽视[22]。已被检测到的染色体包括1p13、1q41、9p21和10q11，其中又以 9p21研究最为广泛，该染色体上的ANRIL(antisenon coding RNA in the INK4 locus)是位于INK4基因座的长度约126 000 bps的lncRNA，ANRIL在动脉粥样硬化多种相关细胞和组织中均有表达；ANRIL不仅可以通过编码细胞增殖调控因子p14、p15和p16的两种基因(细胞周期蛋白依赖性激酶2A基因和细胞周期蛋白依赖性激酶2B基因)发挥作用，还可以通过顺式作用和反式作用调控血管平滑肌细胞的增殖，进而影响冠状动脉疾病的发生发展[23]。基于CHR9P21区域的单核苷酸多态性与冠状动脉疾病有关，科学家检测了CHR9P21区域的变异体与邻近基因信使RNA表达水平的关系，以及与整个基因组中其他基因的关系，结果发现由CHR9P21区域导致的冠状动脉疾病风险变异与ANRIL转录物ENST00000428597信使RNA的表达显著相关，同时也发现一些远程转录与该区域的变异有关，包括众所周知的冠状动脉疾病风险基因腺苷三磷酸结合盒转运体A1[24]。此外，在构建的颈动脉内膜损伤模型中，Wu等[25]发现，抑制lncRNA-p21可导致体内新生内膜的增生；通过建立动脉粥样硬化模型发现，lncRNA-p21能够抑制血管平滑肌细胞和小鼠单核巨噬细胞的细胞增殖，且能够诱导细胞的凋亡；同时，也证明了冠状动脉疾病患者的lncRNA-p21表达是降低的。另外，Leung等[26]通过对lncRNA在血管紧张素(angiotensin，Ang)Ⅱ和高血压分子机制的研究中发现，lnc-Ang362可通过与AngⅡ的作用参与到动脉粥样硬化中去。最近的一系列研究发现，动脉粥样硬化斑块发病机制相关转录物[27]、缺氧诱导因子1α-反义RNA1[28]、MIAT[29]、SENCR(smooth muscle and endothelial cell enriched migration/differentiation-associated long non-coding RNA)[30]等相关基因在血管平滑肌细胞的增殖和凋亡过程中也起到了极为关键的作用。综上，lncRNAs是一类新的细胞增殖和凋亡调节因子，也可作为动脉粥样硬化和相关心血管疾病的治疗靶点。

5 lncRNAs在脂质代谢中的作用

脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化的主要危险因素之一，当脂质代谢发生紊乱时，脂质聚积在动脉内壁进而形成斑块，斑块的破裂和管腔的狭小最终导致血管急性事件的发生。在Cui等[31]的研究中，基于肝癌高表达(highly up-regulated in liver cancer，HULC)是第一个在肝癌中发现的lncRNA的这一发现，建立了HULC通过支持肝癌细胞中异常的脂质代谢而促进恶性发展的假说，并通过一系列的研究证实，HULC在肝癌细胞中作为一种癌基因发挥作用，其机制是通过一个涉及miR-9、过氧化物酶体增殖物激活受体α和长链脂酰CoA合成酶的信号通路来解除对脂质代谢的调控，从而驱动HULC信号转导。研究证明，数百个lncRNAs参与了脂肪生成的调节网络[32]。众所周知，PU.1作为一种参与骨髓淋巴分化的E26特异转录家族转录因子，在脂肪细胞系中也有表达。然而，在前脂肪细胞中，PU.1信使RNA和蛋白质的表达水平与成熟脂肪细胞中的水平并不匹配。基于这一现象，Pang等[33]发现，在前脂肪细胞中，PU.1 AS(antisense)通过与PU.1信使RNA结合形成信使RNA/AS lncRNA双链以阻止信使RNA翻译，从而促进脂肪生成。新的研究证实，血浆中预测心脏重构长链基因间非编码RNA(long intergenic non-coding RNA predicting cardiac remodeling，LIPCAR)的过量表达会导致脂代谢失衡，主要通过降低冠状动脉粥样硬化的保护因素——高密度脂蛋白胆固醇的表达发挥作用，但关于LIPCAR的作用机制需要深入的研究[34]。

6 小 结

lncRNAs从最初不被重视到现在逐渐回归热点，其重要性愈发突出。对lncRNAs作用机制的深入探索，有助于对动脉粥样硬化疾病的全面把握，为动脉粥样硬化疾病的诊疗奠定基础。目前对于lncRNAs的研究虽有重大突破，但尚处于起步阶段，仍需深入挖掘其结构、功能以及与冠状动脉粥样硬化的相关性。期望通过对lncRNAs的精准研究，可以找到预测或直接诊断冠状动脉粥样硬化疾病的特异性lncRNAs的靶基因，借此辅助判断患者患病的严重程度，并通过基因靶向治疗来预防冠状动脉粥样硬化的发生，逆转冠状动脉粥样硬化的病理改变。相信随着技术和检测方法的不断完善，lncRNA在冠状动脉粥样硬化中的临床作用能够不断地被探寻和利用。