延龄草总皂苷提取纯化工艺及其抗肿瘤活性*

姚敏娜，刘利兵，李晓明，白宏

(西安培华学院医学院，西安 710125)

延龄草为百合科植物延龄草(TrilliumtschonoskiiMaxim.) 的干燥根及根茎，为传统名贵中药，也是恩施土家族四大名药之一，具有镇静、止痛、活血、止血等功效，主要用于治疗高血压、神经衰弱、眩晕头痛、腰腿疼痛、月经不调、崩漏、外伤出血、跌打损伤等[1]。延龄草化学成分主要有甾体皂苷、倍半萜苷、黄酮、苯丙素、多糖等，尤以甾体皂苷为主[2]，现代药理学研究表明，该类成分具有抗肿瘤、抗炎、保肝等作用[3-9]。目前，对延龄草皂苷的化学成分和药理活性的研究较多，而有关其提取和纯化工艺鲜有报道，因此，笔者在本实验对延龄草总皂苷的提取和纯化工艺进行系统研究，以期得到纯度较高的有效成分，并考察总皂苷体内外抗肿瘤活性，为延龄草药用资源的合理开发、利用奠定理论基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司，感量：0.01 mg)；KQ5200DE型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；N-1001 旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)； UV1101 紫外/可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)；ZMT-413倒置显微镜(日本Olympus公司)；SpectraMax M5 酶标仪[热电(上海)科技仪器有限公司]。

1.2试药 延龄草采自湖北省神农架林区，经陕西师范大学康杰芳副教授鉴定为百合科延龄草属植物延龄草(TrilliumtschonoskiiMaxin.)的干燥根及根茎；薯蓣皂苷元对照品 (中国食品药品检定研究院，批号：1539-200001)；AB-8(西安蓝晓科技有限公司)、HPD100、HPD400(沧州宝恩化工有限公司)，D101、NAK-9 (天津南开大学化工厂)。RPMI-1640 培养基(美国 HyClone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；噻唑蓝 (MTT，Sigma 公司)；环磷酰胺 (CTX) 注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：15020321)。人宫颈癌Hela细胞株、人肺癌A549细胞株、人乳腺癌MCF-7细胞株、S180 细胞均购自于中国科学院上海细胞生物研究所。

1.3实验动物 清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(20±2) g由第四军医大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK (军)字第2012-007号。

2 方法与结果

2.1延龄草总皂苷含量测定

2.1.1对照品溶液的制备 精密称取薯蓣皂苷元对照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得。

2.1.2供试品溶液的制备 取乙醇浓缩液，用水100 mL转移出残留物，用同体积水饱和正丁醇萃取4次，正丁醇层水浴蒸干，用甲醇溶解并定量至25 mL量瓶中，精密吸取2.5 mL转移至50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。取大孔树脂柱洗脱液适量直接用作其总皂苷含量测定的供试品溶液。

2.1.3检测 波长的确定参照文献[9]方法。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液0.2 mL，置于10 mL具塞试管中，挥干溶剂，精密加入高氯酸5 mL，密塞摇匀，置25 ℃恒温水浴锅中保温25 min，取出冷却至室温。以高氯酸为空白对照，在紫外-可见分光光度计上于350～800 nm波长范围内扫描，测定紫外可见吸收光谱。结果对照品与样品溶液的最大吸收波长均为410 nm，故选择 410 nm为测定波长。

2.1.4线性关系考察 精密吸取对照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，按“2.1.3”项下方法测定吸光度(A值)。以A值为纵坐标，相应溶液中薯蓣皂苷元含量(C)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=0.184 4C+0.001 4，r=0.999 5。结果表明，薯蓣皂苷元在0.01～ 0.1 mg呈良好的线性关系。

2.1.5总皂苷的测定 精密吸取供试品溶液0.2 mL，按照“2.1.4”项下方法测定吸光度值，通过标准曲线计算得到样品总皂苷的含量。

2.2提取工艺研究

2.2.1提取溶剂确定 取延龄草粉末5.0 g，精密称定，分别加入水和30%，50%，70%，90%乙醇，甲醇超声提取，超声时间40 min，温度60℃，料液比(g·mL-1)1：50，滤过，滤液经浓缩回收溶剂后，得乙醇浓缩液按“2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.1.3”项下方法测定总皂苷提取率，结果分别为0.45%，0.78%，1.55%，2.04%，1.83%，2.10%。结果表明甲醇提取率最高，其次是不同浓度的乙醇，水次之，但因甲醇毒性较乙醇大，考虑到安全性、可操作性，且乙醇更适合于工业化生产，因此本实验选择乙醇为提取溶剂。

2.2.2正交实验 经相关文献调研和多次预实验，选择乙醇体积分数、超声时间、料液比、提取温度为考察因素，以延龄草总皂苷提取率及出膏率的综合评分为考察指标，在权重系数上，考虑到总皂苷是延龄草的主要有效部位，浸膏得率也是常用的评价指标，根据实际情况并参照常用比例，将总皂苷提取率和出膏率权重系数分别设为0.7和0.3[10]。称取延龄草粉末9 份，每份5.0 g，按L9(34) 正交表进行实验设计，因素水平见表1，正交实验结果及方差分析见表2，3。

表1 各因素水平表

由直观分析可知，各因素对延龄草总皂苷提取工艺的影响顺序A>C>D>B，即乙醇浓度>料液比>提取温度>超声时间，方差分析表明乙醇浓度和料液比对总皂苷提取率的影响有显著性差异(P<0.05)，其他因素则无显著影响。确定最佳工艺A3B2C3D3，即乙醇浓度80%，超声时间40 min，料液比1：50，提取温度60 ℃。

2.2.3验证实验 按优选的最佳工艺提取3批样品进行验证实验，依法测得延龄草总皂苷的提取率分别为2.10%，2.14%，2.12%，平均提取率为2.12%(RSD=0.94%)，出膏率平均为27.72%，表明最佳提取工艺合理、稳定、可行。

表2 正交分析实验结果

综合评分：c= 30×a/amax+70×b/bmax。

Comprehensive scores: c= 30×a/amax+70×b/bmax.

表3 方差分析表

F0.05(2，2)=19.00。

F0.05(2，2)=19.00.

2.3纯化工艺研究

2.3.1样品溶液的制备 取延龄草粉末200 g，按优化工艺提取，合并提取液，减压回收乙醇，溶液稀释至含生药0.2 g·mL-1，总皂苷浓度4.28 mg·mL-1，过滤，作为纯化工艺的样品溶液。

2.3.2树脂预处理 取适量大孔树脂，加95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀后湿法装柱，用95%乙醇洗脱至流出液加水混合(体积比1：2) 不产生白色浑浊为止，加水洗至无醇味，用5%氢氧化钠溶液5 BV洗脱，加水洗至中性，用5%盐酸溶液5 BV洗脱，水洗至中性，备用。

2.3.3树脂的筛选 参照文献[11]方法。取预处理好的各树脂1.0 g，置于 100 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入含总皂苷 4.28 mg·mL-1的延龄草溶液20 mL，密塞瓶口，置于摇床中，在室温下以120 r·min-1振摇24 h，充分吸附后，测定溶液中总皂苷的量，计算各树脂的静态吸附量。抽滤分开树脂和吸附后的溶液，树脂用蒸馏水洗涤至不滴水为止，置100 mL具塞锥形瓶中，加入95%乙醇20 mL，密塞，同上述条件震荡24 h，充分解吸后，测定解吸液中总皂苷的量，计算各种树脂的解吸率。结果见表 4。从表4可以看出，D101型大孔树脂具有较高的比吸附量和解吸率，因此选用D101型大孔树脂比较合适。

表4 不同型号大孔树脂的静态吸附结果

Tab.4Resultsofstaticadsorptiontestondifferenttypesofmacroporousresins

树脂型号吸附量/(mg·g-1)解吸率/%AB-868.5682.92HPD-10070.1586.59D10175.0189.46HPD-40045.3680.16NAK-938.2979.90

2.3.4泄露曲线的绘制 取已经处理好的D101树脂5 g，湿法装柱，取4.28 mg·mL-1延龄草皂苷提取液缓慢上样，以2 BV·h-1流速接取流出液，每10mL 接1 份，共收集12 管，测定总皂苷含量[12]。结果上样至第9份时流出液中总皂苷含量显著增大，出现明显泄露，故确定最大上样量为80 mL (4BV)。见图1。

图1 延龄草总皂苷泄露曲线

Fig.1LeakagecurveoftotalsaponinsfromTrilliumtschonoskiiMaxim

2.3.5洗脱剂体积分数的考察 取预处理好的D101大孔树脂5 g，湿法装柱，取6 份总皂苷质量分数为4.28 mg·mL-1的样品溶液，每份80 mL，以2 BV·h-1体积流量上样，先用3 BV水脱至流出液无色后，再分别用35%，55%，75%，95%乙醇洗脱至无明显颜色，收集洗脱液，测定不同体积分数的乙醇洗脱得到的解吸液的解吸率。结果解吸率分别为26.52%，55.54%，90.01%，90.45%，随着乙醇浓度的升高，解吸率也在提高，但95% 较75%提高不明显。因此，确定75%乙醇为洗脱剂。

2.3.6洗脱剂用量的考察 取预处理好的D101大孔树脂5 g，湿法装柱，准确吸取上样液80 mL，以2 BV·h-1体积流量上样，先用3 BV水洗至流出液无色，再用75%乙醇以2 BV·h-1的体积流量洗脱8 BV，每 1 BV 收集 1份，测定总皂苷含量，结果见表5。由表5可以看出，第5份以后洗脱液中总皂苷质量浓度已经很低，可认为4 BV时已经把总皂苷基本洗脱完全，从生产成本及洗脱效率方面综合考虑，选定 4 BV 为最佳的洗脱剂用量。

表5 洗脱剂用量的考察

Tab.5Investigationontheeluentamount

流份总皂苷含量/mg142.182103.783112.16453.98流份总皂苷含量/mg59.5267.3275.7683.03

2.3.7纯化工艺验证 根据以上各单因素最佳条件，平行3份，进行验证性实验，经计算，回流提取物中总皂苷纯度分别为7.57%，7.72%，7.64%，而纯化后延龄草总皂苷含量分别为60.23%，62.68%，61.45%，平均含量为61.45%，平均洗脱率为92.08%。

2.4延龄草总皂苷的体外抗肿瘤活性

2.4.1方法 取处于对数生长期的细胞以每孔5×103个，接种于 96 孔板内，置于37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)细胞孵箱中培养24 h。待细胞充分贴壁后，分别加入含不同浓度延龄草总皂苷 (1，5，10，20，40，80，160 μg·mL-1)的RPMI-1640培养液 100 μL，对照组加入含1‰ DMSO培养液100 μL，每组设3个平行孔。将 96 孔板置于培养箱继续培养 24 h。取出培养板，每孔加入5 g·L-1MTT溶液 20 μL，再继续培养4 h。弃去上清液，每孔加入DMSO150 μL，于微量振荡仪上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪上检测各孔490 nm 波长A值，按下面公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=(1-给药组A值/对照组A值) ×100%，并采用SPSS 17.0版统计软件计算得出IC50值。实验重复3次。

2.4.2结果 延龄草总皂苷在体外对MCF-7、Hela、A549 3种肿瘤细胞株均具有一定的抑制作用，IC50依次为(7.89±1.13)，(8.18±1.04)，(28.5±3.16) μg·mL-1，其中对MCF-7及Hela 细胞的抑制作用较为显著。

2.5延龄草总皂苷对小鼠移植S180 肉瘤的抑制作用

2.5.1方法 将在无菌条件下抽取接种 7 d的 S180 肉瘤小鼠腹腔积液，用0.9%氯化钠溶液调节细胞浓度为1×107个·mL-1，接种于小鼠右腋皮下，接种 24 h 后，将50 只小鼠随机平均分为5组，即模型组、环磷酰胺组 (20 mg·kg-1)、延龄草总皂苷小剂量组 (25 mg·kg-1)、中剂量组 (50 mg·kg-1)、大剂量组 (100 mg·kg-1)。除了环磷酰胺组需间隔1 d进行腹腔注射给药外，其他均灌胃给药 10 d，末次给药 24 h 后，处死动物，剪开肿瘤部位，剥离瘤块，用滤纸吸净其上液体，称瘤块质量，计算抑瘤率。同时分离胸腺、脾脏，精密称重，计算脾脏指数、胸腺指数。公式为抑瘤率(%)=(模型组瘤质量-给药组瘤质量) /模型组瘤质量×100%；脏器指数(mg·g-1)=脏器质量(mg)/体质量(g)。

2.5.2结果 延龄草总皂苷对小鼠移植S180 肉瘤的抑制作用见表6。

与模型组比较，环磷酰胺组瘤质量显著降低(P<0.01)，但对小鼠胸腺、脾脏指数具有较强的抑制作用(P<0.01)。与模型组比较，延龄草总皂苷3个剂量组对S180荷瘤小鼠肿瘤生长均有不同程度的下降，抑瘤率分别为12.6%，32.9%，58.0%，其中大剂量组抑瘤率与环磷酰胺组相当，表现出对小鼠移植S180 肉瘤较好的抑制作用。与模型组比较，延龄草总皂苷3个剂量组小鼠胸腺、脾脏指数均无明显改变。

表6 延龄草总皂苷对S180荷瘤小鼠肿瘤生长、脾脏指数和胸腺指数的影响

与模型组比较，t=3.280，*1P<0.05，t=3.876 ～8.048，*2P<0.01。

Compared with model group，t=3.280，*1P<0.05，t=3.876-8.048，*2P<0.01.

3 讨论

与化学治疗(化疗)比较，天然植物作为抗肿瘤药物，具有毒副作用小、降低肿瘤细胞耐药性、提高患者生活质量等优点，因此被广泛关注[13]。新药研发难度越来越大，探索现有的已被广泛用于临床治疗其他疾病的药物的新用途已成为新药开发中最快捷、最有效的策略之一[14]。延龄草作为国家名贵中药，在中国民间尤其是土家族和苗族广泛应用，《中华本草》和《土家族医药学概论》记载，在临床上常用于治疗头晕目眩、头痛、失眠、跌打损伤、神经衰弱等症，疗效显著[1，15]。近年研究发现延龄草具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、凝血以及免疫调节等多种药理作用，因其抗肿瘤活性显著而倍受关注，甾体皂苷是其主要活性成分[2]，而工艺研究鲜见文献报道。

本研究对延龄草总皂苷的提取纯化工艺进行考察，前期比较超声提取和回流提取方法，结果发现，超声法和回流法提取效率相差不大，但超声波提取法可以缩短提取时间、提高效率高、减少操作步骤，最终选用超声提取法。采用正交实验和大孔吸附树脂法确定总皂苷最佳工艺：80%乙醇超声提取40 min，料液比1：50，提取温度60 ℃，提取物调至浓度为4.28 mg·mL-1浓度的延龄草皂苷，经D101大孔树脂，上样体积4 BV，用3 BV水洗脱除杂，4 BV 75%乙醇洗脱，收集75%乙醇部位即得。在此优化条件下将延龄草总皂苷的含量平均提高8.0倍，达到61.45%，平均回收率为92.08%。

对最佳工艺得到的延龄草总皂苷进行了抗肿瘤活性研究。体外实验表明总皂苷对MCF-7、Hela和A549肿瘤细胞具有一定的抑制作用，其中对MCF-7、HeLa细胞的抑制作用较为显著。通过S180小鼠移植瘤模型研究发现，总皂苷各剂量组可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，降低荷瘤小鼠肿瘤质量，且大剂量组抑瘤率与环磷酰胺相当。肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能失调密切相关。在致瘤因素的作用下，机体免疫功能下降会使肿瘤细胞获得更多的生长机会，而当增强机体免疫功能时，肿瘤细胞的生长则可受到限制[16]。胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，其脏器指数是衡量机体免疫功能的初步观察指标。本研究发现延龄草总皂苷各剂量组可以提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，说明总皂苷对免疫器官具有一定的保护作用。而环磷酰胺组脾指数和胸腺指数均显著降低，表明其对免疫系统具有明显抑制作用。

综上所述，经提取纯化得到的延龄草总皂苷纯度较高，工艺稳定，药效实验证明，其具有良好的抗肿瘤作用，且没有常见化疗药抑制免疫系统的副作用，可提高机体免疫功能，具有良好的开发前景。