纳豆芽孢杆菌TK-2产γ-聚谷氨酸发酵工艺优化

王振强，贾俊伟，王 浩，娄军晖

（1.黄河水利职业技术学院，河南 开封 475003；2.天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457；3.旭梅（开封）生物科技有限公司，河南 开封 475003）

纳豆是日本传统的发酵食品之一，起源于我国的豆豉[1]。唐朝时期，鉴真和尚东渡日本将豆豉带到了那里，逐渐演变成为纳豆[2-3]。在我国，李时珍的《本草纲目》中就已经有豆豉可以入药的记载[4]；在日本民间，纳豆长期应用于治疗伤寒、痢疾等疾病[5-6]。20世纪日本研究者须见洋行首次从纳豆中分离出一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），并发现其产生的纳豆激酶具有良好的溶解血栓的功能[7]。1905年，SAUMUR从纳豆中分离出一株γ-聚谷氨酸生产菌，命名为B.nattoSawamura[8]，后来FUJI等学者又证明纳豆中含有γ-聚谷氨酸[9]。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamate acid，γ-PGA）是一种由微生物发酵合成的氨基酸聚合物，通过谷氨酸的α-NH2和γ-COOH以酰胺键结合形成[10]。γ-PGA主链上存在大量肽键，在自然界或人体内可生物降解成短肽小分子和氨基酸单体，不产生毒副作用[11]，分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基（-COOH），易于和一些药物结合生成稳定的复合物[12]，具有优良的生物兼容性和生物降解性，是理想的可生物吸收的医药用高分子材料[13]。本试验选取从纳豆中分离的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）TK-2菌株，通过微生物发酵生产γ-聚谷氨酸，具有容易操作和控制，生产成本较低，产率较高的特点。γ-PGA对环境无污染，为绿色生物产品，被广泛应用于医药制造，食品加工，蔬菜、水果、海产品的防冻、保鲜及植物种子保护等许多领域，是一种具有极大开发价值和广阔应用前景的多功能新型生物制品[14]。本研究通过单因素以及正交试验对Bacillus nattoTK-2产γ-PGA的发酵工艺进行优化，并对其发酵产物进行高效液相色谱（high performance liquid chromatogramphy，HPLC）分析，为γ-PGA的综合开发利用提供理论支撑依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与试剂

Bacillus nattoTK-2菌种：学校食品工程实验室提供；蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、味精等（均为食品级）、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸铵、尿素、乙醇、硝酸钠、氢氧化钠、柠檬酸、硝酸钾等（均为分析纯）：北京百灵威科技有限公司。

1.1.2 培养基

肉汤培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH 7.2，121 ℃，0.1 MPa，灭菌15 min。种子液培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.26%，pH 7.2，121 ℃，0.1MPa，灭菌20min。发酵培养基：碳源2.5%，味精2%，氮源3%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.26%，pH 7.2，分装于250 mL的摇瓶中，每瓶装液50 mL，121 ℃，0.1 MPa，灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

CX43光学显微镜：日本OLYMPUS公司；LRH250C生化培养箱：广东省医疗器材厂；冷冻干燥机：美国KENDRO公司；756型紫外/可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；PHSJ-4A型pH计：上海雷磁公司；AvantiJXN-30型高效离心机：BECKMAN COULTER公司；LC-100PHP型高效液相色谱仪：杭州俊升科学器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的培养

将菌株TK-2接种于肉汤培养基，37 ℃活化培养1 d，再接种于种子培养基中，37 ℃、170 r/min培养12 h，按一定接种量接种于发酵培养基，37 ℃、140 r/min条件下培养。

1.3.2 纳豆芽孢杆菌TK-2生长曲线的测定

利用分光光度法测定[15]。取29 mL空白液再加入1 mL发酵液，混合均匀，倒入比色皿中，在波长660 nm处测定OD660nm值，每隔2 h测定1次，直至菌种由生长期进入到衰退期。

1.3.3γ-聚谷氨酸的纯化

（1）菌体的分离

将发酵液12 000 r/min、4 ℃条件下离心30 min，取上清液备用。

（2）乙醇沉淀

在上清液中缓慢加入3倍体积的体积分数95%乙醇提取，加入后出现蛋清状的物质，缓慢旋转摇瓶，使蛋清状物质慢慢成团聚集，最后用镊子夹出，用去离子水洗涤沉淀物[16]。

（3）丙酮沉淀

将乙醇沉淀后的粗样品溶解在0.015 mol/L、pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中，加入4倍体积的丙酮，缓慢旋转摇瓶，使蛋清状物质慢慢成团聚集，最后用镊子夹出，用去离子水洗涤沉淀物[17]。

（4）透析除盐

把丙酮沉淀提取的沉淀物倒入截流分子质量8 000～12 000 Da的透析袋内，每隔2 h换1次水，4 ℃冰箱中保存，透析6 h，取出进行冷冻干燥称其质量[18]。

1.3.4γ-聚谷氨酸产量的测定

将纯化后的γ-聚谷氨酸冷冻干燥后称质量，计算其产量。

式中：M为制备的γ-聚谷氨酸质量，g；V为发酵液的体积，L。

1.3.5 HPLC分析

称取谷氨酸标准样0.1 g，用蒸馏水定容至10 mL，取1 mL为待测谷氨酸标准样溶液。称取提纯的γ-聚谷氨酸0.1 g，用蒸馏水定容到10 mL，在封闭的磨口水解管中加入1 mLγ-聚谷氨酸溶液和10 mL的6 mol/L的盐酸，37 ℃，水解24 h，12 000 r/min离心30 min，取上清液1 mL为待测γ-聚谷氨酸水解液。

HPLC条件：荧光检测器；HydrosphereC18分析柱（4.6mm×25mm）；流动相：体积比为6∶4的乙腈水溶液；流速：0.5mL/min；检测波长：发射波长350 nm，激发波长450 nm；用0.45 μm的滤膜将样品过滤除去杂质；进样量20 μL。

1.3.6 发酵培养基配方优化单因素试验

（1）碳源种类及添加量的选择

选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、苹果酸、乙酸、麦芽糖、可溶性淀粉、柠檬酸、甘油等10种碳源，按2%水平分别加入到发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA产量，确定最佳碳源。选取最佳碳源，按1%～8%的水平分别加入到发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA产量，确定碳源最佳添加量。

（2）氮源种类及添加量的选择

选取酵母浸粉、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl、尿素、KNO3、NaNO3、（NH4）2SO4、NH4NO310种氮源，按2.5%水平分别加入发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA产量，确定最佳氮源。选取最佳氮源，按0.5%～4.0%的水平分别加入发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA产量，确定氮源最佳添加量。

（3）味精添加量的选择

味精按1%～7%的水平分别加入发酵培养基中，发酵培养，测定γ-PGA含量，确定最佳味精添加量。

（4）初始pH值的选择

选取发酵培养基初始pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的发酵培养，测定γ-PGA产量，确定最佳初始pH值。

1.3.7 发酵培养基配方优化正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取碳源、氮源、味精的添加量3个因素，以γ-PGA产量为评价指标，按表1进行正交试验[19]。

表1 发酵培养基配方优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation medium formula optimization

1.3.8 发酵工艺条件优化单因素试验

（1）装液量的选择

选取装液量分别为30 mL/250 mL、40 mL/250 mL、50mL/250mL、60mL/250mL、70mL/250mL、80mL/250mL、90 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140 r/min振荡培养24 h，测定γ-PGA含量，确定最佳的装液量。

（2）接种量的选择

装液量为70mL/250 mL，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，37 ℃、140 r/min振荡培养24 h，测定γ-PGA产量，确定最佳接种量。

（3）培养温度的选择

装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，培养温度分别为28 ℃、32 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃，140 r/min振荡培养24 h，测定γ-PGA产量，确定最佳培养温度。

（4）转速的选择

装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃，转速分别为80 r/min、110 r/min、140 r/min、170 r/min、200 r/min振荡培养24 h，测定γ-PGA产量，确定最佳的转速。

1.3.9 发酵动态曲线的绘制

在优化的最佳培养基和最佳发酵培养条件下进行摇瓶发酵实验，发酵培养30 h，每隔3 h从摇床上取下一瓶，测定发酵液的γ-PGA产量及其在波长660 nm处的OD660nm值，绘制Bacillus nattoTK-2的发酵动态曲线[20]。

2 结果与分析

2.1 纳豆芽孢杆菌TK-2的生长曲线

每隔2 h测定波长660 nm处种子的OD660nm值，测定30 h菌种的生长状态，直至菌种由生长期进入到衰退期，生长曲线如图1。

图1 纳豆芽孢杆菌TK-2生长曲线Fig.1 Growth curve of Bacillus natto TK-2

由图1可以看出，纳豆菌生长6 h开始进入对数生长期，12 h进入对数生长的中期，在12 h时把种子液接种到发酵液中。

2.2 发酵培养基配方的优化

2.2.1 碳源种类及添加量的确定

装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140 r/min振荡培养24 h。不同的碳源对γ-PGA产量的影响如图2，碳源添加量对γ-PGA产量的影响结果见图3。

图2 不同碳源对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on γ-polyglutamic acid yield

由图2可以看出，葡萄糖和蔗糖做为碳源的γ-PGA的产量比麦芽糖等其他碳源相对较好，可能是葡萄糖和蔗糖作为培养基的碳源比较有利于菌体的发酵反应。结合经济条件考虑，选择葡萄糖为最佳碳源比较合适。

图3 葡萄糖添加量对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.3 Effect of glucose addition on γ-polyglutamic acid yield

由图3可以看出，随着葡萄糖添加量的增加，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当葡萄糖添加量为2%时，γ-PGA产量最高。再增加葡萄糖添加量，γ-PGA产量逐渐降低。这是因为当葡萄糖添加量太低时，不够菌体生长所需；而当葡萄糖添加量过大时，对菌体的生长及γ-PGA的生成有抑制作用。综合分析，选择葡萄糖添加量为2%比较合适。

2.2.2 氮源种类及添加量的确定

装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140 r/min振荡培养24 h。不同的氮源对γ-PGA产量的影响如图4，氮源添加量对γ-PGA产量的影响结果见图5。

图4 不同氮源对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.4 Effect of different nitrogen sources on γ-polyglutamic acid yield

由图4可以看出，蛋白胨、牛肉膏等有机氮源对发酵液中生成γ-PGA产量比氯化铵、硫酸铵等无机氮源高。而有机氮源中蛋白胨对发酵液的γ-PGA产量的效果要优于其他的有机氮源，可能是蛋白胨做为培养基中的有机氮源更有利于菌体的发酵反应。综合分析，选择蛋白胨为最优氮源。

图5 蛋白胨添加量对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.5 Effect of peptone addition on γ-polyglutamic acid yield

由图5可以看出，随着蛋白胨添加量逐渐增大，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当蛋白胨添加量为2.5%时，发酵液中γ-PGA产量最高，而再增加蛋白胨添加量，γ-PGA产量逐渐降低。这是由于发酵反应初期，菌体的浓度比较大，随着蛋白胨添加量的加大，菌体与蛋白胨接触比较充分，发酵反应比较充分，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，即使增大蛋白胨添加量，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择蛋白胨添加量为2.5%比较合适。

2.2.3 味精添加量的确定

装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140r/min振荡培养24h。味精不同添加量对γ-PGA产量的影响结果见图6。

由图6可以看出，随着味精添加量的增加，发酵液中γ-PGA产量逐渐增大，当味精添加量为2%时，发酵液中γ-PGA产量最高。再增加味精添加量，γ-PGA产量逐渐降低。这是由于发酵反应初期，菌体的浓度比较大，随着味精添加量的加大，菌体与味精接触比较充分，发酵反应比较充分，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，浓度降低，即使增大味精添加量，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择味精添加量为2%比较合适。

图6 味精添加量对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.6 Effect of monosodium glutamate addition on γ-polyglutamic acid yield

2.2.4 初始pH值的确定

装液量为70 mL/250 mL，接种量2%，37 ℃、140r/min振荡培养24 h。不同初始pH值对γ-PGA产量的影响结果见图7。

图7 初始pH值对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.7 Effect of initial pH on γ-polyglutamic acid yield

由图7可以看出，随着初始pH值的增大，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当初始pH值为7.5时，发酵液中γ-PGA产量最大。再增大初始pH值，γ-PGA产量显著降低。这是因为发酵过程中，初始pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，影响培养基中营养物质的离子化程度和微生物对营养物质的吸收，过酸性或过碱性环境都不利于菌种的发酵生长，初始pH值为7.5时比较有利于发酵反应的进行。综合分析，选择初始pH值为7.5比较合适。

2.3 发酵培养基配方优化正交试验结果

在单因素试验的基础上，选取葡萄糖添加量、蛋白胨添加量和味精添加量3个因素，设计正交试验，优化发酵培养基条件。正交试验结果见表2、方差分析结果见表3。

由表2和表3可以看出，最佳培养基配方为A3B2C2，即葡萄糖添加量2.5%，蛋白胨添加量2.5%，味精添加量2%。葡萄糖添加量、蛋白胨添加量和味精添加量对γ-PGA产量的影响因素大小为：A＞C＞B，即葡萄糖添加量＞味精添加量＞蛋白胨添加量，葡萄糖添加量具有显著性的影响（P＜0.05），蛋白胨添加量和味精添加量均无显著性的影响（P＞0.05）。

表2 发酵培养基配方优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation medium formula optimization

表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

综上所述，根据单因素试验及正交试验优化，发酵培养基最佳配方为：葡萄糖2.5%，蛋白胨2.5%，味精2%，pH 7.5。

2.4 发酵培养条件优化单因素试验

2.4.1 装液量的确定

图9 装液量对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.9 Effect of loading volume on γ-polyglutamic acid yield

不同装液量对γ-PGA产量的影响如图8。由图8可以看出，随着装液量的增加，γ-PGA产量逐渐增大，当装液量达到70 mL/250 mL时，γ-PGA产量最高。再增大装液量，γ-PGA产量有较大幅度降低。综合分析，选择装液量为70mL/250mL比较合适。

2.4.2 接种量的确定

不同接种量对γ-PGA产量的影响如图9。由图9可以看出，随着接种量的增加，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当接种量为2%时，发酵液γ-PGA产量最大。再增加接种量，γ-PGA产量缓慢降低。这是因为发酵反应初期，菌体的浓度比较大，随着接种量的加大，菌体与种子接触比较充分，发酵反应比较充分，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，浓度降低，即使增大接种量，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择接种量为2%比较合适。

图9 接种量对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.9 Effect of inoculum on γ-polyglutamic acid production

2.4.3 发酵温度的确定

不同温度对γ-PGA产量的影响如图10。由图10可以看出，随着培养温度的升高，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当培养温度达到37 ℃时，γ-PGA产量最大。再升高培养温度，γ-PGA产量显著降低。这是因为发酵反应初期，菌体的浓度比较大，升高温度可以加快发酵反应速度，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，浓度降低，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择培养温度为37 ℃比较合适。

图10 发酵温度对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.10 Effect of fermentation temperature on γ-polyglutamic acid yield

2.4.4 转速的确定

不同转速对γ-PGA产量的影响如图11。由图11可以看出，随着转速的加大，发酵液中的γ-PGA产量逐渐增大，当转速达到140 r/min时，γ-PGA产量最大。再加大转速，γ-PGA产量开始降低。这是因为发酵反应初期，菌体的浓度比较大，加大转速可以加快发酵反应速度，随着反应的进行，菌体逐渐消耗，浓度降低，发酵反应程度也会降低。综合分析，选择转速为140 r/min比较合适。综上所述，最佳发酵培养条件：装液量70 mL/250 mL，接种量2%，培养温度37 ℃，转速140 r/min，振荡培养24 h，在此条件下进行验证试验，γ-PGA产量为11.48 g/L，产量提高了57.2%。

图11 转速对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.11 Effect of shaking speed on γ-polyglutamic acid yield

2.5 发酵动态曲线

在优化的最佳培养基和最佳发酵培养条件下进行摇瓶发酵30 h，每隔3 h从摇床上取下一瓶，测定波长660 nm处的OD660nm值，绘制Bacillus nattoTK-2的发酵动态曲线如图12，γ-PGA的产量动态曲线如图13。

图12 Bacillus natto TK-2的发酵动态曲线Fig.12 Fermentation dynamic curve of Bacillus natto TK-2

由图12、图13可以看出，菌体在最佳发酵条件下能够快速的生长，经过3 h很快进入对数生长期，在21 h菌体进入平稳期。γ-聚谷氨酸的生成基本上与菌体的生长同步，从0～12 h生产γ-聚谷氨酸是缓慢的，在12～24 h能够较快速度地生成γ-PGA。之后随着发酵培养基营养物质的消耗，γ-PGA的产量趋于稳定并且有下降的趋势。

图13 γ-PGA的产量动态曲线Fig.13 Dynamic curve of γ-PGA yield

2.6 HPLC分析

谷氨酸标准溶液和γ-PGA水解溶液的高效液相色谱图如图14所示。

图14 谷氨酸标准溶液（A）以及γ-聚谷氨酸水解溶液（B）的高效液相色谱图Fig.14 HPLC chromatogram of glutamate acid standard (A) and γ-polyglutamic acid hydrolytic solution (B)

由图14可以看出，γ-PGA水解产物只有一种氨基酸，并且与谷氨酸标准溶液的出峰时间基本相同，初步证明了γ-PGA为谷氨酸的一种聚合物，水解样与标准样比对基本一致。

3 结论

通过单因素试验及正交试验优化确定Bacillus nattoTK-2发酵产γ-PGA的最佳培养基配方：葡萄糖2.5%，蛋白胨2.5%，味精2%，pH7.5；最佳发酵培养条件：装液量70mL/250mL，接种量2%，培养温度37 ℃，转速140 r/min；在此条件下进行验证试验，γ-PGA产量为11.48 g/L，产量提高了57.2%。

采用HPLC测定分析，γ-PGA是谷氨酸的一种聚合物，其水解产物只有一种氨基酸，并且与谷氨酸标准溶液的出峰时间基本相同。本研究成果为γ-PGA的综合开发利用提供理论支撑依据。