环氧二十碳三烯酸通过线粒体途径保护缺血/再灌注损伤机制的研究进展

叶永才，陈哲璇，李 想，谭伟江，杨丰华*，张良清*

(1.广东医科大学附属医院麻醉科，广东 湛江 524000；2.广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室，广州 510633)

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是一种常见的病理过程，广泛发生于急性心肌梗死、急性肾衰竭、脑中风等缺血缺氧性疾病过程[1]。I/R可引起组织器官的损伤和功能障碍，并带来严重的并发症，因而减轻I/R带来的损伤对患者病情的好转和康复至关重要。另外，随着近年来医疗水平的提高，器官移植手术日益增多，如何减少器官移植过程带来的I/R损伤也是亟待解决的问题。在组织器官I/R损伤中，线粒体因其在生成ATP以及在细胞凋亡中发挥关乎细胞存亡的关键作用而备受重视，许多促生存信号通路作用于线粒体这个终效应器来维持细胞膜的完整性并阻止细胞死亡[2]，因此，如何维持线粒体结构和功能成为减轻I/R损伤策略的关键点。

近年的研究结果表明环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)是一种适合治疗组织器官I/R损伤的成分。EETs是一类生物活性很强的脂质环氧化合物，已有许多研究证明EETs与心、脑、肾等重要器官的I/R过程密切相关，其中抗炎、抗凋亡等作用机制在EETs的I/R保护作用中发挥至关重要的作用，这与EETs介导的抗凋亡机制密切相关，同时线粒体途径也是组织器官I/R损伤防治的重要靶标，因此线粒体途径在EETs介导的I/R损伤保护作用中具有重要地位。然而作为I/R损伤防治的重要靶点，线粒体途径在EETs介导的I/R损伤保护作用中却未得到很深入的探讨，并且分子机制仍未完全阐明。本文就线粒体途径在EETs保护I/R损伤中的作用进行总结，并指出潜在的研究方向。

1 EETs的生物学功能

花生四烯酸(arachidonic acid，AA)是一种广泛存在于人体内的多元不饱和脂肪酸，在体内的代谢途径主要有3种，即环氧化酶途径(cyclooxygenase pathway，COX)、脂氧合酶途径(lipoxygenase pathways，LOX)和细胞色素P450途径(cytochrome P450，CYP)。其中AA经CYP途径代谢后会产生EETs，主要包括5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET四种区域异构体[7]。体内的EETs可被可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)快速代谢成生物活性低的二羟基二十碳三烯酸(dihydroxyeico satetraenoic acids,DHETs)，其许多潜在有益作用也随着被转化为DHETs而减弱。研究发现EETs具有扩血管、抗炎、促纤溶、调节血管生长等多种生物学功能。同时，EETs作为许多组织信号通路的重要组成部分能增加细胞内促生存和抗凋亡信号通路的表达[8-9]。另外研究还发现抑制sEH的表达能减少内源性EETs的降解，在I/R损伤中起到保护作用[3-5]，因此提高体内EETs 的有效浓度成为研究EETs生物学作用及机制的研究方法。

2 组织器官缺血/再灌注损伤

组织器官缺血后重新得到血液再灌注在多数情况下可使组织器官功能得到恢复,但有时缺血后的再灌注反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤，这种在缺血基础上恢复血流后组织进一步的损伤，甚至不可逆性的现象称为缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤[10]。组织器官I/R引起的缺氧会影响细胞ATP的产生，而ATP作为保证细胞各项生命活动的能量供应者，它的消耗会引发诸如膜离子泵衰竭、细胞钾外流、细胞内和线粒体钙超载等缺血性级联反应[11]。另外组织器官I/R还会引起活性氧的产生、炎症细胞的聚集、内质网应激和缺血后毛细血管无复流的发生。这些病理过程的发生最终会导致线粒体K+通道受损、线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的开放以及线粒体结构异常[12]，最终导致细胞裂解和死亡。

3 EETs防治缺血/再灌注损伤的重要靶标：线粒体

EETs作为许多组织信号通路的重要组成部分能增加细胞内促生存和抗凋亡信号通路的表达[8-9]，能有效减轻组织器官的I/R损伤，其中线粒体是EETs防治I/R损伤的重要靶点。线粒体是具有双膜结构的广泛分布于细胞内的细胞器，它的主要作用是通过线粒体电子传递链经氧化磷酸化以ATP的形式产生细胞能量，在细胞能量稳态中发挥关键作用。除能量产生外，线粒体也是活性氧的主要来源[13]，同时还涉及细胞凋亡、自噬和坏死性细胞凋亡等细胞死亡的调节[14]，是细胞存活和死亡的关键。

组织器官I/R时会导致线粒体活性氧的大量产生，过量的活性氧直接导致线粒体呼吸链和代谢酶的氧化损伤[15]，同时也会破坏线粒体膜结构并增加mPTP开放[16]。线粒体通透性的增加则会使促凋亡因子向细胞质的释放增多[17]，最终导致细胞凋亡并加剧各种组织器官中I/R诱导的损伤，因此线粒体功能障碍被认为是导致组织器官I/R损伤的标志之一。研究表明EETs能有效通过抗炎与抗凋亡等作用机制减轻组织器官的I/R损伤[3-6]，其中线粒体途径在这些机制中起着至关重要的作用[2]，这提示EETs能通过保护线粒体减少组织器官的I/R损伤。然而线粒体尽管在EETs介导的I/R保护作用中的占有重要地位，但相关保护作用中却未得到很深入的探讨，并且分子机制仍未完全阐明，这值得我们进行深入研究。

4 EETs保护线粒体免受缺血/再灌注损伤的作用机制

研究表明EETs和sEH抑制剂能有效减轻组织器官I/R损伤引起的线粒体功能障碍。目前人们认为EETs主要通过以下几个途径来保护线粒体免受I/R损伤(详见表1)：①EETs激活线粒体K+通道；②EETs限制mPTP开放；③EETs减少线粒体促凋亡蛋白的激活；④EETs维持线粒体结构的完整性。

4.1 EETs与线粒体K+通道

EETs能够作用于包括线粒体ATP敏感性钾(mitochondrial ATP-sensitive K+,mito-KATP)通道和线粒体Ca2+激活的K+(mitochondrial calcium-activated potassium,mito-KCa)通道在内的线粒体K+通道来减轻组织器官的I/R损伤。mito-KATP位于线粒体内膜上，由内向整流钾通道和ATP 结合蛋白两部分组成，其主要功能是将K+转运至线粒体基质内调节线粒体内K+的浓度从而影响线粒体能量代谢，同时还参与线粒体的氧化磷酸化过程进而维持线粒体跨膜电位的稳定性[18]。研究表明mito-KATP的激活能减少线粒体内膜的部分去极化、线粒体钙超载以及活性氧的产生，从而赋予缺血后组织器官保护作用[19]。而EETs被证明能激活mito-KATP通道，如在CYP过表达即内源性增高EETs浓度的小鼠中，赋予的心脏保护作用涉及mito-KATP通道的激活[20]。同时用外源性EETs处理野生型小鼠心肌细胞也能通过增加线粒体的氧化还原状态，表明EETs能激活mito-KATP通道[20]。在进一步的EETs调控mit-KATP机制研究中，Katragadda D 等[21]用mito-KATP的抑制剂5-HD进行实验发现EETs通过减少线粒体应激而起作用，相关的研究也表明磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信号通路参与了EETs激活mito-KATP通道的过程[22]，但此调控通路可能不是唯一通路，Sreedhar B[23]等发现即使PI3K被抑制EETs也能刺激mito-KATP通道的激活，并且在mito-KATP通道阻滞剂作用下也会发生PI3K-Akt的激活，提示在EETs调控mito-KATP通道的保护作用中有更加复杂的信号调控机制，有待进一步的研究探讨。

mito-KCa通道也是线粒体K+离子通道的一种，mito-KCa通道可以通过细胞内Ca2+的升高和膜去极化被激活,进而促进细胞线粒体K+的摄取，减少Ca2+流入引起的线粒体Ca2+超载，提示mito-KCa通道的激活在组织I/R损 伤中具有保护作用[24]。进一步的研究表明天然缺失mito-KCa通道使得组织更容易受到I/R损伤[25]。EETs被证明能激活mito-KCa通道，如Katragadda D 等[21]用mito-Kca通道抑制剂PAX 处理心肌组织，结果发现它消除了EETs对缺血组织的保护作用，但EETs通过什么途径作用于mito-KCa通道并不清楚。有证据表明PKA或PKC在涉及K+通道的I/R损伤保护途径中起重要作用[26]，那么PKA或PKC通路很可能是EETs激活mito-KCa的一种机制，这需要进一步的实验来确定EETs介导的I/R损伤保护作用是否涉及PKA或PKC向线粒体的早期激活或共定位。

4.2 EETs与线粒体通透性转换孔

mPTP是线粒体内膜上的蛋白质复合物，由ATP合酶的二聚体构成，是细胞死亡的关键效应器，在正常生理条件下mPTP保持闭合，它的开放受基质亲环蛋白D(cyclophilin D,CyPD)的调节[27]。组织器官I/R时，由于细胞缺乏氧供，线粒体代谢功能会受到抑制进而引起线粒体Ca2+超载、氧化应激、腺嘌呤核苷酸消耗和线粒体去极化等不良反应，在这些不良反应作用下mPTP持续开放。mPTP的开放会允许> 1.5×103的分子自由通过，这引发细胞渗透压的变化和氧化磷酸化的解偶联，最终导致细胞死亡[28]。EETs被证明能抑制mPTP的开放从而减轻组织器官I/R损伤，如Katragadda D等[21]发现EETs能减少由氧化应激引起的H9C2心脏细胞线粒体内膜电位(mitochondrial membrane potential，ΔΨm)的损失和mPTP的开放，同时也指出EETs介导的保护作用可能通过限制ΔΨm的损失减缓mPTP的开放，并有研究指出EETs可能通过PI3K-AKT信号通路来影响ΔΨm以达到限制mPTP的开放[29]。进一步的mPTP开放的机制研究表明，AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)的内在激活对于防止在再灌注期间过量的线粒体活性氧产生和随后的JNK信号传导至关重要，能够限制mPTP的开放进而减轻不可逆的线粒体损伤[30]。由于EETs能通过激活AMPK和增强Akt的核转位来减轻心脏肥大[31]，提示我们EETs很可能通过激活AMPK 信号通路进而限制mPTP的开放，从而减轻组织器官的I/R损伤。

表1 EETs保护线粒体免受I/R损伤的途径及作用机制

随着近年来高通量细胞实时成像技术的发展，研究者可以更好的对一些细胞亚结构进行观察。最近一项研究通过同时对500至1000个单独的线粒体进行实时成像，发现mPTP的激活机制涉及瞬时低电导开口，被称为MitoWinks[32]。这种MitoWinks能通过重置单个线粒体以限制线粒体基质钙超载，进而以较小的能量成本来促进线粒体和细胞存活[32]，但EETs是否会引起MitoWinks还有待研究，这可能是未来研究EETs通过线粒体途径保护组织器官I/R机制的一个新焦点。

4.3 EETs与线粒体促凋亡蛋白

细胞凋亡的内在途径即线粒体相关途径在组织器官I/R损伤过程中发挥重要的作用，其中线粒体外膜上的促凋亡蛋白扮演着重要的角色。研究发现用EETs预处理缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)细胞以及利用具有EETs模拟特性和sEH抑制特性的新型双功能化合物UA-8处理小鼠离体心脏都能够减弱细胞的凋亡[33-34]。有趣的是有报道指出EETs可以激活PI3K/Akt信号通路并防止肺动脉内皮细胞凋亡[35]，提示EETs在组织器官I/R中可能是通过PI3K/Akt信号通路调节线粒体相关途径发挥抗凋亡作用，这在Wenshu C等[36]的研究中得到证实。他们通过肺组织I/R模型，发现肺组织缺血会导致线粒体功能障碍和NADPH氧化酶的激活，导致活性氧过量产生进而调节Bcl-2家族蛋白的表达和激活Caspase-3来触发细胞凋亡过程。同时I/R诱导的这些有害作用会通过CYP过表达或外源性增加EETs处理而减弱，并且CYP和EETs的保护作用会被被PI3K-Akt抑制剂LY294002阻断，表明EETs的保护作用至少部分通过PI3K-Akt途径调节位于线粒体外膜的Bcl-2家族蛋白的表达进而在组织I/R损伤中发挥抗凋亡作用[36]。但是细胞凋亡涉及非常复杂的信号传导通路，提示我们可以关注其它相关信号通路，例如最近有研究发现EETs可以通过靶向JNK/c-Jun信号通路抑制氧葡萄糖剥夺对脑微血管平滑肌细胞凋亡的作用[37]，那么EETs是否也通过JNK/c-Jun信号通路调节线粒体途径发挥组织I/R损伤的保护作用，这可能也是未来研究的一个方向。

4.4 EETs与线粒体结构完整性

线粒体的结构由外至内可划分为线粒体外膜、线粒体膜间隙、线粒体内膜和线粒体基质四个功能区。其中线粒体内膜向内皱褶形成线粒体嵴，是许多生化反应的重要场所。线粒体的结构完整性一旦受到破坏就会引起线粒体功能的障碍。研究发现EETs能够保护线粒体结构的完整性维持线粒体的正常功能。El-Sikhry等[38]在HL-1心肌细胞饥饿模型中,通过评估ADP/ATP比率和氧化呼吸能力发现，EETs在心肌细胞饥饿胁迫期间能增加OPA-1寡聚体水平和线粒体嵴密度，保留线粒体功能，延长细胞对饥饿应激的应答的存活期，揭示了EETs在调节线粒体中的新作用。Akhnokh等[39]利用sEH 敲除鼠和对应的野生型小鼠进行心梗造模，并用sEH抑制剂tAUCB治疗，结果发现 tAUCB治疗或sEH缺乏可以通过减少EETs的降解显著减轻线粒体结构损伤从而改善心肌梗死后的收缩和舒张功能，同时还发现抑制sEH会使线粒体酶活性显着改善，进而说明EETs可以保留缺血性损伤后的线粒体功能。然而EETs如何将保护信号传达到线粒体并保持其结构的完整性并未探索明白。有研究认为小窝蛋白1(Caveolin-1，Cav-1)可能起到一个信号传达的作用，Chaudhary等[40]从I/R的野生型小鼠心脏中分离出心肌细胞的质膜和线粒体，结果显示其中Cav-1缺失以及细胞膜穴样内陷的缺乏，而从EETs处理后的心脏中分离的质膜和线粒体则存在Cav-1和细胞膜穴样内陷,提示Cav-1信号传导可能是EETs介导保护信号到线粒体从而引起保护效应的一个新机制，但还需更多的研究加以证明。

5 小结与展望

综上所述，EETs能通过调节线粒体K+通道、mPTP、线粒体促凋亡蛋白以及线粒体结构的完整性在组织器官I/R损伤中发挥重要的保护作用。作为组织器官I/R损伤防治的重要靶点，线粒体结构和功能稳定性的维持一直是研究的重点。而EETs作为一种能保护组织器官I/R损伤的脂质环氧化物，其对线粒体的作用机制尽管部分已经得到阐述，但仍然还有很多未知的机制存在，这就需要我们接下来深入去探索。全面深入了解EETs作用于线粒体的机制对于寻找新的防治方式，发现新的治疗靶点来保护组织器官I/R损伤有着重要的意义。