Axl高表达对裸鼠胃癌细胞皮下成瘤的影响

田苗苗，田祖宏，张慧霞，张 莹，宁思明，聂勇战，胡思隽

(第四军医大学西京消化病医院/空军军医大学第一附属医院 肿瘤生物学国家重点实验室，西安 710032)

胃癌是世界第四大肿瘤，全球胃癌致死率位居所有肿瘤第二位，是我国死亡人数最多的恶性肿瘤之一，对人类健康具有很大的威胁[1]。尽管针对胃癌的发生发展已经取得了诸多进展，但是由于胃癌患者的早诊率低和多重耐药等限制，预后仍然较差[2]。胃癌主要治疗措施包括手术治疗及化疗。胃癌化疗治疗方案中，一类重要的靶点是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)。

RTKs是一个跨膜激酶蛋白家族，可以通过和配体结合及磷酸化等模式激活下游信号通路进而激活一系列生化反应，参与多种生命活动，包括组织修复和凋亡清除、免疫调控等[3-4]。Axl(Anexelekto)是RTKs的一种，其在不同类型癌症中均有较高表达，参与调控肿瘤细胞的增殖侵袭和转移，并且与癌症的不良预后相关[5-9]。Axl可介导肺癌、乳腺癌、头颈和食管鳞状上皮细胞癌等肿瘤的增殖、迁移、转移及耐药等[10-12]。Axl信号通路在胃癌组织和细胞系中高表达，可能通过Akt信号通路调控胃癌细胞增殖，然而具体调控机制仍不明确[13]。为了进一步探讨Axl与胃癌发生发展之间的关系，本研究着眼于Axl表达量与胃癌之间的关系及Axl高表达对对裸鼠胃癌系皮下成瘤的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性BALB/c裸鼠(5 ～ 6周龄，约20 g)购自北京维通利华有限公司[SCXK (京)2016-0011]；饲养于空军军医大学实验动物中心[SYXK (陕)2014-001]，12 h昼夜交替，温度保持在23℃ ～ 25℃，相对湿度恒定在40% ～ 60%，自由饮食。实验分为两组，每组8只。实验动物设计符合福利伦理要求，实验动物福利伦理审批号：20190214，本实验符合动物实验的3R原则。

1.1.2 组织样本

收集第四军医大学西京消化病医院(空军军医大学第一附属医院)2008年至2010年间经病理检查的胃癌和癌旁组织101例，交由上海芯超生物科技有限公司制备为胃癌和癌旁芯片。实验所用组织均经病人本人和家属同意，并签署知情同意书，且经过医学伦理委员会审批，伦理委员会批件号：KY20192088-F-1。

1.1.3 细胞系

人胃癌细胞SGC-7901细胞购自上海吉凯生物公司。

1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清购自四季青公司；1640培养基和胰酶购自美国Gibco公司；过表达慢病毒购自上海吉凯生物公司；抗Axl抗体购自美国CST公司；免疫组化用山羊抗兔IgG和DAB显色试剂盒均购自中杉金桥公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司。激光共聚焦扫描显微镜(FLUOVIEW FV10I)购自美国Olympus公司；小动物活体成像仪(Lumina2)购自美国PE公司。

1.3 实验方法

1.3.1 高表达Axl细胞的构建

SGC-7901细胞以2×106个/孔密度铺于六孔板中，过夜贴壁后加入适量具有绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的慢病毒(过表达慢病毒Let-Axl或对照慢病毒Let-Null)，共培养24 h后更换培养基。72 h后加入嘌呤霉素筛选已转染细胞，荧光显微镜观察同时进行Western blot和定量PCR检测确定转染效率。转染成功可进行细胞传代和后续研究。

1.3.2 裸鼠皮下成瘤及小动物活体成像

BALB/c裸鼠(6周)16只用于成瘤实验，将胃癌细胞SGC-7901/Let-Axl和SGC-7901/Let-Null消化后，PBS清洗两次，去除残留培养基，将1×106个细胞接种于裸鼠的右侧背部皮下，每周观察裸鼠的状态、肿瘤的生长状况[14]。于第二和四周时，对裸鼠进行麻醉后，利用小动物活体成像仪进行荷瘤裸鼠活体成像并拍照(生物发光，激发波长488 nm，发射波长507 nm)[15]。

1.3.3 定量PCR

采用总RNA提取试剂盒对细胞总RNA进行提取，逆转录试剂盒进行逆转录，定量PCR试剂盒进行定量。内参为GAPDH，引物序列GAPDH-F(5’→3’): GCACCGTCAAGGCTGAGAAC；GAPDH-R(5’→3’): TGGTGAA-GACGCCAGTGGA；Axl引物序列为Axl-F(5’→3’): CCGGGTTCATCAACATC AA；Axl-R(5’→3’): CTGACATTCTCGAGATCGA。

1.3.4 Western blot检测

用RIPA裂解液将细胞裂解并用细胞刮收集，测定总蛋白浓度后，每孔上样40 μg蛋白，150 V恒压电泳40 min，100 V恒压转PVDF膜1 h。5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜后，相应二抗室温孵育2 h，通过ECL试剂盒发光检测。

1.3.5 免疫组化

组织切片于60℃烤箱烘烤2 h。常规脱蜡(依次为)：二甲苯、二甲苯、无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，其中二甲苯浸泡10 min，乙醇浸泡5 min。抗原修复：在清水中漂洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中煮沸3 min(中火)，待高压锅中煮沸后将组织片置于其中高压修复2 min，冷却至室温。灭活内源性过氧化氢酶：在清水中冲洗一段时间，加入3% H2O2浸泡10 min。血清封闭：将载玻片置于PBS中5 min，清洗2次，山羊血清封室温下封闭30 min。加一抗：加入Axl抗体(稀释浓度1∶300)，以PBS作为作为阴性对照组，4℃孵育过夜。加二抗：PBS中洗3次，每次5 min，加二抗，然后置于37℃温箱中30 min。显色：PBS中洗3次，每次5 min，擦干组织周围的PBS后加DAB显色剂。镜下观察组织染色情况至合适深浅。将显色后的片子用清水冲洗15 min后，浸泡于苏木精中染色1 min。脱水：水中冲洗5 min后，依次将载玻片放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯。每个试剂中放置2 min，最后浸泡在二甲苯中，通风柜中用中性树脂封片晾干。

1.3.6 表达分级判断标准

免疫组化表达分级通过两方面打分评判：(1)阴性为0；阳性占0%～33%的记作1；34%～66%的记作2；67%～100%的记作3。(2)染色强度：分别将未显色、浅黄、棕黄和棕色记为0、1、2、3四个等级。将两个评分相乘并分为0、1、2和3四个表达强度等级。

1.3.7 细胞免疫荧光染色

多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次后山羊血清封闭1 h。一抗4℃孵育过夜后，用相应荧光二抗室温孵育2 h，DAPI室温染色10 min，加入抗淬灭剂封片保存。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 胃癌组织中Axl高表达

为了观察胃癌组织中Axl的表达情况，我们收集了本院消化外科胃癌手术病人手术切除组织并制作胃癌组织芯片。经过免疫组化染色，Axl在胃癌组织中的表达量显著高于癌旁组织(图1)。101例免疫组化统计结果见表1。胃癌组织中，强度为中阳性(++)和强阳性(+++)分别有34例和7例，而在癌旁组织中，强度为中阳性(++)和强阳性(+++)分别只有5例和0例。胃癌组织中Axl表达量显著高于癌旁组织(P<0.001)。

2.2 Axl高表达细胞构建

为了深入研究Axl高表达与胃癌发生发展之间的关系，我们首先构建了高表达Axl的SGC-7901细胞。经过慢病毒Let-Axl的转染，通过定量PCR技术检测表明，SGC-7901/Let-Axl中Axl mRNA的含量显著高于SGC-7901/Let-Null组(P<0.001，图2 A)。进一步检测发现，SGC-7901/Let-Axl中Axl蛋白含量显著高于SGC-7901/Let-Null(图2B)。免疫荧光染色也表明SGC-7901/Let-Axl细胞中Axl含量明显升高(图2C)。

注：A：胃癌组织；B：癌旁组织。

表1胃癌组织与癌旁组织Axl蛋白表达水平

Table1Axl expression levels in gastric cancer tissues and adjacent tissues

组别Groups表达分级Rank-++++++nP胃癌组织Gastric cancer tissues3030347100癌旁组织Adjacent tissues692750101<0.001

注：A：定量PCR结果；B：Western blot检测Axl表达量；C：免疫组化结果。**P<0.01，***P<0.001。比例尺为20 μm。

注：A：小动物活体成像结果；B：小动物活体成像荧光强度统计(皮下注射肿瘤细胞4周后)。**P<0.01。

2.3 小动物活体成像检测Axl对胃癌肿瘤的影响

为了进一步研究Axl高表达对胃癌的影响，我们进行了裸鼠皮下胃癌细胞成瘤实验。在分别注射Axl高表达细胞SGC-7901/Let-Axl及其对照细胞SGC-7901/Let-Null两周后，通过小动物活体成像可以看出，高表达Axl的SGC-7901细胞所成皮下瘤荧光强度大于对照组，在注射肿瘤细胞4周后，再次进行小动物活体成像，结果显示，SGC-7901/Let-Axl所成皮下瘤荧光强度显著大于对照组(图3A)。荧光强度分析结果显示，注射SGC-7901/Let-Axl所形成肿瘤在小动物活体成像下荧光强度显著高于SGC-7901/Let-Null(P<0.01，图3B)。以上结果显示，SGC-7901/Let-Axl成瘤能力显著高于SGC-7901/Let-Null，Axl高表达可以增强胃癌细胞SGC-7901的皮下成瘤能力。

2.4 高表达Axl增强胃癌细胞皮下成瘤能力

裸鼠皮下接种胃癌细胞4周后，SGC-7901/Let-Axl所形成的肿瘤明显大于SGC-7901/Let-Null组(图4A、4B)。处死裸鼠后，取出皮下瘤，对其体积和重量进行测量。相对于对照组SGC-7901/Let-Null，高表达Axl细胞SGC-7901/Let-Axl所形成的皮下瘤的体积显著增大(P<0.01，图4C)，质量也显著增大(P<0.01，图4D)。这些结果表明，Axl高表达能够增强胃癌细胞皮下成瘤能力。

3 讨论

胃癌是我国第二大恶性肿瘤，致死率亦位居第二[1]。尽管胃癌的诊断和治疗技术有了很大改进，但胃癌患者的5年总生存率仍然不能令人满意[2]。癌症化疗治疗方案中，RTKs是一类极其重要的靶点。进一步深入研究RTKs与胃癌的关系，具有重要的临床意义。

Axl是RTKs家族中重要的一员，在多种肿瘤中有过表达或异位表达，可以激活相关通路参与肿瘤的增殖、迁移、转移、凋亡抑制和耐药性[16]。研究表明，急性白血病细胞可以诱导骨髓间质细胞分泌Gas6，从而介导表达Axl的急性白血病细胞进行增殖、存活和耐药性。在食管鳞状细胞癌中，Axl高表达且与生存期呈负相关[17]。在胰腺癌中，Axl与淋巴结转移呈现正相关，与生存期呈现负相关[18]。在肝癌中，Axl可以促进原发性肝癌的细胞增殖和侵袭能力[19]。

在本研究中，我们检测了进行胃癌外科手术患者的胃癌及癌旁组织中的Axl的表达量，结果显示，胃癌组织相比与癌旁组织，Axl表达量显著升高，这提示Axl与胃癌的发生发展可能具有密切的关系。为了确定Axl参与胃癌发生发展，我们构建Axl高表达胃癌细胞，在裸鼠体内进行皮下成瘤，通过小动物活体成像检测证实，Axl高表达能够显著提高胃癌细胞的皮下成瘤能力，处死动物后，取瘤组织测量体积和重量，确认了与活体成像结果的一致性。本研究一系列结果提示，Axl与胃癌的发生和发展可能具有密切的关系。

Axl已成为多种肿瘤的治疗靶点和潜在的生物标志物，多种针对Axl的小分子抑制剂也已面市。我们通过本研究证实，Axl与胃癌的发生和发展可能具有密切的关系，可能可以作为胃癌预防、早诊及治疗的关键分子。基于本研究结果，经过后续深入研究探索，有望开发出以Axl为靶点治疗胃癌的新型有效的抗肿瘤药物和以Axl为胃癌标志物的诊断试剂盒。

注：A：裸鼠皮下瘤生长情况；B：Axl高表达及对照组所形成的皮下瘤；C：皮下瘤体积；D：皮下瘤质量。**P<0.01。红色圆圈所示为裸鼠皮下瘤。