lncRNA TUG1对高糖诱导的小鼠足细胞MPC5凋亡的影响

马 媛，张大鹏，王 想，任 蕾

1)驻马店市中心医院内分泌科 河南驻马店 463000 2)郑州大学第一附属医院内分泌科 郑州 450052

糖尿病肾病是糖尿病重要的并发症之一，表现为肾功能衰退、高血压、蛋白尿等，糖尿病肾病也是终末期肾病发生的主要原因[1]。大鼠足细胞凋亡是糖尿病肾病发生的重要病理变化[2]。牛磺酸调节基因1(taurine up-regulated gene 1，TUG1)是一种长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，在人体正常细胞功能维持以及疾病发生过程中发挥关键作用[3]。研究[4]发现，TUG1不仅参与肿瘤的发生发展过程，还参与动脉粥样硬化等疾病的发生过程。前期研究[5]表明，TUG1与糖尿病肾病足细胞的能量代谢有关，TUG1在糖尿病肾病发生过程中表达下调。该研究用小鼠足细胞MPC5体外构建糖尿病肾病足细胞损伤模型，观察内质网应激标志蛋白表达的变化，探讨TUG1在高糖条件下足细胞凋亡中的作用，为明确TUG1在糖尿病肾病损伤中的作用提供参考，为基因治疗糖尿病肾病提供思路。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂小鼠足细胞MPC5购自美国ATCC细胞库，细胞培养条件为饱和湿度、37 ℃、体积分数5%CO2培养箱，培养基为含体积分数10%胎牛血清的DMEM；反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Cleaved-Caspase-12)、裂解的多聚ADP核糖聚合酶(Cleaved-PARP)抗体购自美国Santa Cruz 公司；内质网应激标志蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)、磷酸化真核细胞翻译起始因子2α(p-eIF2α)、78 000葡萄糖调节蛋白(GRP78)抗体购自美国Abcam公司；TUG1过表达CMV-EGFP慢病毒和阴性对照PMT406空载体慢病毒均由北京合生基因科技有限公司构建。

1.2细胞分组及处理足细胞分别用含5.5和25.0 mmol/L葡萄糖的细胞培养液培养，记为对照组(A组)和高糖组(B组)。MPC5细胞培养至对数生长期后接种到24孔板，每孔105个细胞，细胞融合度为50%左右时添加慢病毒液(MOI=15)，同时加入5 mg/L聚凝胺，感染12 h后更换细胞培养液，继续培养48 h后以含1 mg/L聚凝胺的细胞培养液培养7 d，筛选稳定感染的细胞。感染TUG1过表达慢病毒和阴性对照慢病毒的MPC5细胞以含25.0 mmol/L葡萄糖的细胞培养液培养，记为阴性对照高糖组(C组)和TUG1过表达高糖组(D组)。每组3个复孔。

1.3qRT-PCR检测各组MPC5细胞中TUG1的表达4组细胞培养48 h后，采用qRT-PCR方法检测细胞中TUG1的表达。PCR引物由南京金斯瑞生物科技公司合成，序列如下：β-actin 上游引物5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物5’-TG TAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’；TUG1上游引物5’-TAACAGCCCTCCACTCCAGAT-3’， 下游引物5’-AGGCACCAGCTTCAAAACCC-3’。以Trizol试剂提取细胞总RNA，然后用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度。用反转录试剂盒进行反转录，体系为4 μL 4×Prime Script Buffer、2 μL总RNA、1 μL Oligod T 引物、1 μL反转录酶混合液Ⅰ、1 μL随机六核苷酸引物，添加无RNA酶水至20 μL。反转录条件：37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。PCR反应体系：上下游引物各1 μL、2 μL cDNA、1.6 μL DyeROX、10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ，添加 ddH2O至20 μL。PCR反应条件：95 ℃孵育30 s，95 ℃孵育10 s，60 ℃孵育30 s，共40个循环。按照2-ΔΔCt法计算TUG1相对表达量。实验重复3次。

1.4细胞凋亡率的检测4组细胞培养48 h后，添加2.5 g/L的胰蛋白酶将细胞消化成单细胞悬浮液，PBS洗涤后将细胞悬浮在250 μL的结合缓冲液中，然后在细胞中添加5 μL的PI以及5 μL的Annexin V-FITC溶液，室温下孵育15 min，添加300 μL的结合缓冲液，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.5Western blot法测定细胞中Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白的表达4组细胞培养48 h后，添加蛋白提取试剂，冰上裂解20 min，高速离心后吸取上清，用BCA方法进行定量。将蛋白样品同Loading Buffer混匀煮沸变性后添加到样品孔内，每孔30 μg，先80 V恒压电泳约30 min，然后以120 V的电压电泳2 h。将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，然后将PVDF膜放在封闭液中，室温孵育1 h。取出PVDF膜，置于一抗稀释液(Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP稀释度为1∶800，CHOP、p-eIF2α、GRP78稀释度为1∶1 000)中，4 ℃过夜。PVDF膜与HRP标记的二抗在室温中孵育2 h后，ECL显色发光，定影，用Quantity One软件测定蛋白条带的灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0分析数据。不同组间TUG1表达、Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白相对表达量和细胞凋亡率的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞TUG1表达、凋亡率和Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP蛋白相对表达量的比较结果见图1和表1。与A组相比，B、C、D组细胞凋亡率升高，Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP蛋白相对表达量升高；与B、C组相比，D组细胞凋亡率降低，Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP蛋白相对表达量降低。

1：A组；2：B组；3：C组；4：D组

组别TUG1凋亡率/%Cleaved-Caspase-12Cleaved-PARPA组1.00±0.118.32±0.470.18±0.020.35±0.04B组0.56±0.07∗26.91±3.24∗0.47±0.06∗0.74±0.09∗C组0.58±0.07∗25.89±2.28∗0.48±0.08∗0.73±0.06∗D组1.63±0.18∗#16.71±1.36∗#0.32±0.03∗#0.46±0.04∗#F55.51951.44721.40730.873P<0.001<0.001<0.001<0.001

*：与A组比较，P<0.05；#：与B、C组比较，P<0.05

2.2 4组细胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白相对表达量的比较结果见图2和表2。与A组相比，B、C、D组细胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白相对表达量升高；与B、C组相比，D组细胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白相对表达量降低。

1：A组；2：B组；3：C组；4：D组

组别CHOPp-eIF2αGRP78A组0.33±0.050.23±0.040.57±0.06B组0.68±0.06∗0.60±0.08∗0.98±0.09∗C组0.70±0.07∗0.59±0.09∗0.99±0.12∗D组0.49±0.06∗#0.36±0.05∗#0.68±0.07∗#F25.04121.18317.510P<0.001<0.001<0.001

*：与A组比较，P<0.05；#：与B、C组比较，P<0.05

3 讨论

糖尿病肾病作为终末期肾病发生的首位病因，其发生机制十分复杂，肾小球基底膜增厚是常见的病理变化[6]。足细胞功能异常是糖尿病肾病发生的机制之一，也是肾小球硬化和蛋白尿产生的重要原因[7]。陈恩平等[8]用高糖处理永生化小鼠足细胞后发现Bax表达升高，Bcl-2表达降低，细胞凋亡率升高，证明高糖可诱导足细胞凋亡。本实验结果显示，高糖处理后的足细胞凋亡率增加，Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP蛋白表达水平升高。Caspase-12是Caspase蛋白家族的成员，其只有被激活形成Cleaved-Caspase-12才可以发挥促凋亡作用[9]。PARP也是细胞凋亡发生的促进因子，其被活化后形成Cleaved-PARP是细胞凋亡发生的标志之一[10]。本实验结果说明高糖可诱导足细胞发生凋亡。

TUG1是一个在小鼠视网膜中发现的lncRNA，定位在22q12.2染色体上，参与血管生成、细胞耐药等过程，还与人体肿瘤发生有关[11]。Lei等[5]发现在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠和高糖处理的MPC5细胞中TUG1水平降低，高糖处理的MPC5细胞凋亡增加；黄芪甲苷Ⅳ处理可上调TUG1表达水平并减少足细胞凋亡，说明TUG1可能参与糖尿病肾病的发生发展。Long等[12]发现，TUG1参与了糖尿病肾病足细胞的能量代谢，诱导足细胞产生ATP。本实验结果表明，高糖处理后的足细胞中TUG1表达水平降低，与上述研究结果一致；过表达TUG1高糖诱导的足细胞凋亡率显著降低，Cleaved-Caspase-12、Cleaved-PARP表达水平降低，说明过表达TUG1可以抑制高糖诱导的足细胞凋亡，TUG1在糖尿病肾病足细胞损伤中可能发挥保护作用。

CHOP、p-eIF2α、GRP78是内质网应激的标志蛋白，近些年来，内质网应激被认为是细胞凋亡发生的途径之一，内质网应激发生时GRP78大量表达，并激活CHOP和Caspase-12，诱导细胞凋亡；PERK与GRP78解离后活化eIF2α，活化的eIF2α诱导CHOP的表达进而诱导细胞凋亡[13-14]。研究[15]显示高糖处理的足细胞中GRP78、p-PERK、Caspase-12蛋白表达水平升高。本实验结果显示，高糖诱导的足细胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达水平升高，过表达TUG1高糖诱导的足细胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达水平降低，表明TUG1可能通过减弱高糖诱导的足细胞内质网应激而抑制细胞凋亡发生，这可能是TUG1调控细胞凋亡的机制之一。

总之，TUG1在糖尿病肾病进展中可能发挥保护作用，过表达TUG1可能通过抑制内质网应激而减少高糖诱导的足细胞凋亡。本实验结果为明确TUG1在糖尿病肾病发生中的作用提供了参考，为基因靶向治疗糖尿病肾病提供了可能。