B7-H1基因rs4143815位点多态性与结直肠癌发病风险的关联研究

马晓骉，张 麒，潘定国

(云南省肿瘤医院生物治疗中心，云南 昆明 650118)

程序性死亡因子1配体B7同系物1(B7 homology 1，B7-H1)，又称CD274，是共刺激分子B7超家族中最重要的成员之一，可通过负向调节免疫反应抑制T细胞活化和增殖，促进癌细胞的免疫逃逸。人类多种肿瘤类型，包括结直肠癌中B7-H1呈高表达，是患者预后不良的指标之一[1-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是内源性的长度约为18～24个核苷酸的非编码RNA，通过与靶基因 3′-非翻译区(3′-untranslational region，3′-UTR)互补结合，发挥mRNA降解或蛋白抑制作用。miRNA靶位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可影响基因表达，进而影响肿瘤的易感性[5-6]。前期有研究显示位于B7-H1基因3′-UTR区的rs4143815位点的等位基因突变破坏了miR-570介导的转录后调控，增加了胃癌的发病风险[7-8]。本研究探讨B7-H1基因rs4143815位点多态性与中国人群结直肠癌发病风险的关联，并分析其与B7-H1 mRNA表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

病例组来源于云南省肿瘤医院2012年3月至2017年5月入院无亲缘关系的215例结直肠癌患者，均为汉族，取EDTA抗凝外周静脉血标本。入选标准：①病理学确诊为结直肠癌患者；②未经放化疗治疗。排除标准：①结直肠癌手术复发者；②结直肠转移癌而非原发性肿瘤者。对照组外周静脉血标本236例选自同期到医院进行体检的健康人群。排除有肿瘤病史、肿瘤家族史和非汉族个体。其中，病例组男性125例，女性90例，平均年龄(59.0±12.3)岁。临床I-II和III-IV期患者各108和107例，高分化和中低分化癌各158和57例，有无淋巴结转移各77和138例。对照组男性148例，女性88例，平均年龄(58.4±9.7)岁。性别和年龄在病例和对照组中的分布差异无统计学意义(P＞0.05)。

另外，收集手术切除结直肠癌和癌旁正常组织样本(距癌组织5 cm以上的远端组织)65例，液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。

1.2 试剂和仪器

血液和组织DNA提取试剂盒、Trizol试剂、TIANScriptⅡ RT Kit、FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)均购自北京天根生化科技有限公司；PCR仪和定量PCR仪均为德国Eppendorf公司产品。

1.3 DNA提取及序列测定

采用血液基因组DNA提取试剂盒(提取全血基因组DNA，分光光度法测定DNA浓度和纯度。运用直接测序法对B7-H1基因rs4143815位点进行分型。参考文献[9]合成引物，引物序列如下：5′-GATACACATTT GGAGGAGACG-3′(上游)，5′-CAAATACTCCATGTTT TACTAG-3′(下游)。PCR反应体系 50 μL，包含2 ×PCR buffer 25 μL、上游引物 2 μL、下游引物 2 μL、模板DNA 2.5 μL和去离子水18.5 μL。混匀，置于PCR仪中，设置如下反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物送擎科生物科技有限公司测序。

另外，采用组织DNA提取试剂盒提取65例结直肠癌和癌旁正常组织样本DNA，采用上述方法对B7-H1基因rs4143815位点进行PCR扩增，扩增产物送擎科生物科技有限公司测序。

1.4 定量PCR

Trizol试剂提取65例结直肠癌和癌旁组织总RNA，分光光度法测定RNA浓度和纯度。TIANScriptⅡ RT Kit反转录合成cDNA，FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)进行扩增。B7-H1定量PCR扩增引物：5′-GGTGGTGCCGACTACAA-3′(上游)，5′-TAGCCCT CAGCCTGACAT-3’(下游)。以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参照，引物序列如下：5′-ATGGGGA AGGTGAAGGTCG-3′(上游)，5′-GGGGTCATTGATGG CAACAATA-3′(下游)。按照 FastFire qPCR PreMix试剂盒说明配制反应体系，混匀，置于定量PCR仪，设置如下反应条件：94℃、5 min，94℃、30 s，60 ℃、35 s，40个循环。采用 2-ΔΔCT法计算结直肠癌中B7-H1 mRNA的相对表达水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件统计分析数据。采用拟合优度卡方检验分析B7-H1基因rs4143815位点在病例组和对照组中的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。运用logistic回归计算比值比(odds ratio，OR)和95%置信区间(confidence interval，CI)，OR经性别和年龄调整。秩和检验分析B7-H1 mRNA在不同组别中表达变化。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

病例组和对照组中均检测到B7-H1基因rs4143815位点3种基因型，分别为CC、CG和GG基因型，3种基因型在对照组中的频率分别为37.7%、44.1%和18.2%，在病例组中的频率分别为27.9%、44.2%和27.9%。经检验，均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，P值分别为 0.32和0.20。

2.2 B7-H1基因rs4143815位点多态性与结直肠癌风险的相关性

运用测序法检测结直肠癌组和对照组外周静脉血中B7-H1基因rs4143815位点多态性，并分析其与结直肠癌风险的相关性，见表1。与对照组相比，GG和CG/GG基因型显著增加了结直肠癌的发病风险[GG与CC相比：OR调整=1.99，95%CI(1.19，3.34)，P=0.008；CG/GG与CC相比：OR调整=1.58，95%CI(1.06，2.36)，P=0.02]。C和G等位基因在对照组中的频率分别为59.7%和40.3%，在病例组中的频率均为50.0%。与对照组相比，G等位基因显著增加了结直肠癌的发病风险[OR调整=1.48，95%CI(1.14，1.93)，P=0.004]。分层分析显示，B7-H1基因rs4143815位点多态性与结直肠癌临床分期、分化程度和淋巴结转移等无明显相关。

表1 B7-H1基因rs4143815位点多态性与结直肠癌的相关性

2.3 B7-H1基因rs4143815位点多态性与结直肠癌中B7-H1 mRNA表达的相关性

定量PCR检测B7-H1 mRNA在65例结直肠癌和癌旁组织中的表达，如图1A所示，B7-H1 mRNA在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P=0.02)。B7-H1 mRNA在不同肿瘤临床分期(I-II期和III-IV期)、分化程度(高中分化与中低分化)和淋巴结转移状态(有和无)等生物学行为中的差异无统计学意义(图1B～D)。进一步对比B7-H1基因rs4143815位点多态性与结直肠癌中B7-H1mRNA表达的相关性，发现65例结直肠癌组织中，B7-H1基因rs4143815位点CC基因型18例，CG基因型29例，GG基因型18例。B7-H1基因rs4143815位点GG基因型患者B7-H1 mRNA水平明显高于B7-H1基因rs4143815位点CC基因型患者(P=0.03)，见图1E。

图1 B7-H1 mRNA相对表达量

3 讨论

B7-H1作为重要的免疫治疗靶点，在肿瘤的治疗过程中已经取得了一定效果。作为负性调控分子，B7-H1在生理状况下表达较低，肿瘤细胞中表达明显增加[1-4]。既可与其受体PD1结合抑制B细胞活化，又可与非PD1受体结合诱导细胞毒性T淋巴细胞凋亡，参与肿瘤细胞的免疫逃逸。B7-H1表达一致的不同个体罹患肿瘤的风险不尽相同，提示遗传变异可能影响不同个体对肿瘤的易感性不同。以往多项研究均证实该观点[10-11]。

最近，国内外研究表明B7-H1基因rs4143815位点多态性与多种肿瘤的发病有关。Wang等[8，12]研究小组发现B7-H1基因rs4143815位点GG基因型增加了胃癌的发病风险。Xie等[13]报道B7-H1基因rs4143815位点GG基因型携带者血清中B7-H1表达明显升高，罹患肝癌的风险明显增加[OR调整=1.62，95%置信区间(1.26，2.06)]，预示着更差的预后。相反，程仕光等[9]发现携带B7-H1基因rs4143815位点GG基因型肝癌患者总体生存时间延长。Tan等[14]报道B7-H1基因rs4143815位点GG基因型显著增加了卵巢癌的发病风险[OR=2.34，95%置信区间(1.27，～4.30)]，但是对应的B7-H1 mRNA表达量却显著降低。虽然B7-H1基因rs4143815位点多态性与肺腺癌、鳞状细胞癌和非小细胞肺癌发病和预后无关[15-16]。但是，携带B7-H1基因rs4143815位点CC和CG基因型的晚期非小细胞肺癌患者对尼鲁单抗更敏感，经过治疗后具有更好的客观缓解率和无进展生存期[17]。然而，Zhou等[18]报道B7-H1基因rs4143815位点多态性与食管鳞状细胞癌的发病风险和预后无关。与以上阳性结果相同，本研究发现B7-H1基因rs4143815位点GG基因型和G等位基因携带者结直肠癌的发病风险分别增加了1.99和1.48倍，提示可能是结直肠癌的易感基因之一。全基因组关联研究显示，人类染色体9p24是结直肠癌的一个易感位点[19]，B7-H1基因恰好位于9p24.1，因此，本研究结果在遗传学层面是合理的。

鉴于B7-H1基因rs4143815位点多态性位于B7-H1基因3′-UTR区miR-570结合“种子区”，C到G的转变破坏了B7-H1基因与miR-570的结合，影响了B7-H1的表达[8]，由此推测，B7-H1基因rs4143815位点多态性增加结直肠癌发病风险的可能机制是B7-H1基因rs4143815位点GG基因型通过miR-570调控B7-H1 mRNA的表达。为验证该推测，本研究运用定量PCR分析了结直肠癌组织中B7-H1 mRNA的表达，并分析了其与B7-H1基因rs4143815位点多态性的关系，发现结直肠癌组织中B7-H1 mRNA高表达，与以往研究结果一致[1-4]；并且携带B7-H1基因rs4143815位点GG基因型的结直肠癌患者B7-H1 mRNA表达量明显高于CC基因型携带者。该研究结果与Xie等[13]在肝癌中观察到的结果一致，证实了B7-H1基因rs4143815位点GG基因型增加了B7-H1 mRNA表达进而增加了结直肠癌的易感性这一假设。

本研究存在一定的局限性：①样本例数较小，可能没有足够的检验效能；②2012年设计收集样本时，未采用问卷调查，遗失一些重要信息，例如遗传结构分析等。未来有必要开展设计严密、大样本、多群体的前瞻性研究验证本研究结果。

综上所述，B7-H1基因miR-570结合位点rs4143815的GG基因型增加了中国汉族人群结直肠癌的发病风险，可能机制是增加了B7-H1 mRNA的表达，提示B7-H1基因rs4143815位点多态性有望作为新的靶点用于结直肠癌免疫治疗。