亚硒酸钠与白藜芦醇联用对肺癌细胞抗氧化和细胞周期蛋白的影响

万鹰昕，张 平，李 楠

(北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023)

【关键字】亚硒酸钠；白藜芦醇；抗氧化；周期蛋白

据研究表明，肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和威胁最大的恶性肿瘤之一[1]，其中，80%以上为非小细胞肺癌[2]。硒是一种对机体具有生物活性调节能力的基本元素，也是生物所必需的微量元素。硒通过自身或中间产物来保护细胞免受自由基的损伤[3-4]。亚硒酸钠具有肿瘤预防、化疗增敏和促进细胞凋亡的作用[5-6]。亚硒酸钠还具有抗氧化、消除体内的氧自由基与过氧化物、抗炎反应、抗高血压、抗重金属等药理作用[7-8]。亚硒酸钠是目前应用最普遍的硒强化剂，但其安全浓度范围非常窄，高剂量对生物体有毒害作用。

白藜芦醇是一种普遍存在于自然界的多酚类化合物，近年研究表明，白藜芦醇对机体无毒副作用，其药理作用主要是抗氧化、抗自由基等方面，从而预防癌症和心血管疾病[9-11]。但白藜芦醇价格高，且单独作用于肺癌细胞相对于亚硒酸钠效果不明显[12]。为减轻硒作用于癌细胞时的毒副作用，张平等人研究了亚硒酸钠与白藜芦醇联合应用于肺癌细胞，结果表明与亚硒酸钠单独作用于肺癌A549细胞相比，25 μmol/L白藜芦醇和亚硒酸钠的联合使细胞的存活率更低，且当亚硒酸钠浓度≥5 μmol/L时，与对照组相比，肺癌细胞的存活率明显降低[12]。但相关机制还不清楚。为此，本论文研究亚硒酸钠与白藜芦醇联用对肺癌细胞抗氧化性和细胞周期蛋白的影响，以便进一步理解亚硒酸钠与白藜芦醇联用对肺癌细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肺癌A549细胞购于中国协和医科大学基础医学研究所。亚硒酸钠、白藜芦醇、四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)，购于美国Sigma公司；胎牛血清、胰蛋白酶(含EDTA与不含EDTA)、DMEM/F12培养基，购于美国Hyclone公司；细胞凋亡分析试剂盒，购于美国Genview公司；微量谷胱甘肽(glutathione，GSH)测试盒、细胞丙二醛(Malondialdehyde，MDA)测试盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)测试盒，购于南京建成科技有限公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 主要仪器与设备

多功能酶标仪、恒温培养箱，为美国 Thermo公司产品；超净工作台，北京百剑空气净化设备厂；TE2000-M倒置显微镜，购于日本Nikon公司；BS110S型电子天平，美国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养细胞复苏后进行传代培养。在进行传代过程中，PBS缓慢冲洗1～3次，勿吹起细胞，用胰蛋白酶酶解细胞，在倒置显微镜下观察，底壁上约80%细胞呈现圆粒状，细胞间连接将要分离时，迅速吸掉胰酶溶液，避免胰蛋白酶处理过度。然后向100 mm×20 mm培养皿内加入新鲜培养液4 mL，小心吹起皿底的细胞，尽量避免产生气泡，再分装。

1.3.2 实验分组实验组分为对照组、亚硒酸钠组、白藜芦醇组、亚硒酸钠和白藜芦醇联用组。根据张平等人的研究[12]，本实验将亚硒酸钠和白藜芦醇的浓度定为2.0和25.0 μmol/L。对照组含A549细胞和无血清培养基。

1.3.3 四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性A549细胞在培养皿中培养，取对数期的细胞，在96孔板中铺板，在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中继续培养24 h，然后加配制好的受试物，处理24 h，吸弃废液，添加MTT溶液处理4 h，再用DMSO处理10 min，最后用酶标仪检在532 nm波长处测定D(532)值,按下式计算A549细胞的存活率。

A549 细胞存活率=[D(532)实验组-D(532)空白组]/[D(532)对照组-D(532)空白组]

空白组为不含A549细胞的实验组。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧将对数生长期的细胞配制成浓度为3×105个/mL的细胞悬液，再于6孔板中按1 mL/孔添加混匀的细胞悬液，37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h。然后加入受试物，培养箱中培养24 h。用检测细胞凋亡的试剂盒进行处理，最后用流式细胞术检测细胞凋亡情况；同样，用检测ROS的试剂盒进行处理，然后用流式细胞术检测细胞的ROS情况。

1.3.5 酶标仪检测谷胱甘肽、丙二醛的表达水平将对数生长期的细胞配制成浓度为3×105个/mL的细胞悬液，再于6孔板中按1 mL/孔添加混匀的细胞悬液，37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养24 h。然后加入受试物，接着培养24 h。分别用检测GSH、MDA试剂盒进行处理，最后用酶标仪检测GSH、MDA的表达水平。

1.3.6 Western blot检测P-Rb蛋白实验分组同1.3.2，用药物处理A549细胞后，收集细胞，提取总蛋白，然后用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白样品浓度。上样同样质量总蛋白后电泳、转膜、封闭，一抗4℃孵育过夜，用TBST洗后，加入二抗，室温孵育2 h，用TBST洗后，用化学发光试剂盒检测P-Rb蛋白表达；用显影仪扫描并拍照，对显示的目的蛋白和相应β-actin的条带进行灰度分析，以目的蛋白和内参β-actin条带灰度的比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.4 统计分析

所有计量资料以平均值±标准差(xˉ±s)的形式表示，用SPSS软件统计分析数据，采用单因素方差分析判断各处理组之间的差异显著性，LSD Duncan法检验进行两两比较，并用Origin作图软件分析。

2 结果

2.1 亚硒酸钠与白藜芦醇联用对肺癌A549细胞存活率和凋亡率的影响

采用四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡，结果见表1。与对照组相比，2 μmol/L亚硒酸钠单独处理可使A549细胞存活率降低、凋亡率升高(P＜0.01)；25 μmol/L白藜芦醇单独处理后细胞存活率和凋亡率与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。当亚硒酸钠和白藜芦醇联用后，细胞的存活率降低至46.867%，且凋亡率上升至3.790%，相较于两个单独处理组，其存活率和凋亡率与对照组的差异性更为显著(P均＜0.01)，这说明联用组能降低细胞的存活率，促进A549细胞凋亡。

表1 亚硒酸钠与白藜芦醇钠对A549细胞存活和凋亡的影响

图1 亚硒酸钠联合白藜芦醇对A549细胞GSH和MDA表达水平的影响

2.2 亚硒酸钠联合白藜芦醇对A549细胞GSH和MDA表达水平的影响

用酶标仪检测A549细胞中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的表达水平，结果见图1。亚硒酸钠与白藜芦醇单独处理组GSH表达水平与对照组相比差异无统计学意义。亚硒酸钠与白藜芦醇联用组较对照组和单独处理组的GSH表达水平显著降低(P＜0.05)。

亚硒酸钠和白藜芦醇单独处理组MDA表达水平与对照组相比差异无统计学意义，但亚硒酸钠与白藜芦醇联用组MDA表达水平与对照组比较显著升高(P＜0.05)。结果表明，亚硒酸钠与白藜芦醇联用后对细胞造成了一定的氧化损伤。

2.3 亚硒酸钠联合白藜芦醇对A549细胞ROS水平的影响

亚硒酸钠和白藜芦醇对A549细胞ROS水平的影响见图2和表2。与对照组相比，亚硒酸钠单独处理可显著增加A549细胞内ROS水平(P＜0.05)，白藜芦醇单独处理可显著降低A549内ROS水平(P＜0.05)，而亚硒酸钠和白藜芦醇联用后，细胞内ROS表达水平与对照组和白藜芦醇单独处理组相比显著升高(P＜0.05)，与亚硒酸钠单独处理组相比差异无统计学意义。表明亚硒酸钠和白藜芦醇联用能导致ROS水平升高。

表2 不同组别A549细胞ROS和周期蛋白相对表达量

2.4 亚硒酸钠联合白藜芦醇对细胞周期蛋白P-Rb的影响

Rb是一种抑癌基因表达的蛋白，可以通过调控细胞周期G1期的检验点来调节细胞增殖。Western blot检测P-Rb蛋白的表达，结果见图3和表2。与对照组相比，亚硒酸钠组A549细胞的P-Rb蛋白表达水平降低(P＜0.05)，白藜芦醇组A549细胞的P-Rb的表达水平与对照组间的差异无统计学意义；但亚硒酸钠与白藜芦醇联用组p-Rb的水平较对照组、亚硒酸钠组和白藜芦醇组单独处理组均显著降低(P＜0.05)。

图2 流式细胞术检测不同组别A549细胞ROS水平

图3 Western blot检测结果条带

3 讨论

亚硒酸钠是一种对机体细胞有一定毒性作用的无机硒化合物，白藜芦醇是从植物体内提取出来的天然活性成分且在一定范围内对机体细胞无毒副作用。亚硒酸钠(2 μmol/L)和白藜芦醇(25 μmol/L)单独处理A549细胞时，细胞存活率分别为77.43%和111.67%，但两者联合处理后，细胞存活率为46.87%。生物体供能的主要来源和合成ATP激素及许多生理活性所不可缺少的物质都是氧。但机体在利用氧的同时，氧自身也发生了一系列反应，生成包括超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟自由基等氧自由基或活性氧簇的ROS。而ROS生成后一般会被一些特定的酶类清除。当细胞内自由基生成过量或抗氧化防御系统受损时，ROS的产生和清除的动态平衡遭到破坏，导致ROS水平升高。ROS的大量堆积会引起细胞氧化应激或脂质过氧化等，最终使细胞凋亡或死亡[13]。机体参与抗氧化作用的酶主要包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽转移酶等。若这一机制受到损伤，则多余氧自由基就会直接作用于机体，导致机体损伤。当各种致癌因素使氧自由基产生过量、机体抗氧化和修复机制受损时，机体就会产生氧化应激的损伤，并导致各种肿瘤的产生。捕捉和清除自由基、保护DNA蛋白质等生物大分子免受活性氧损害，才能抑制肿瘤生长[14]。GSH是细胞内重要的自由基清除剂，可以与细胞内的自由基或超氧离子反应，拮抗细胞的氧化损伤。通过细胞内GSH表达水平的测定，可以反映出细胞内的氧化还原水平。MDA是细胞脂质过氧化的主要产物之一。可以通过细胞内MDA的表达水平了解细胞膜脂质过氧化程度，从而间接了解细胞膜系统受损程度。本研究结果显示，亚硒酸钠单独处理后，A549细胞内GSH表达水平有所降低，MDA表达水平和ROS表达水平有所升高。白藜芦醇单独处理后，细胞内ROS表达水平降低，而GSH和MDA表达水平的活力均无显著性变化。亚硒酸钠和白藜芦醇联用后与亚硒酸钠单独处理相比，ROS表达水平有所上升，GSH表达水平降低和MDA表达水平升高。ROS在细胞中具有双重的功能，其既能通过DNA损伤和线粒体途径诱导细胞凋亡，也能通过激活其它信号通路来调节细胞的生存或死亡状态。

细胞周期调控在细胞增殖和凋亡中起重要的作用。张平等[12]在研究亚硒酸钠与白藜芦醇联合应用对肺癌细胞的协同作用的实验中发现，亚硒酸钠和白藜芦醇联用能够阻滞肺癌A549细胞于细胞周期的G0/G1期。联用组肺癌A549细胞P-Rb蛋白的相对蛋白质表达水平差异显著(P＜0.05)，这可能可以解释联用使肺癌A549细胞的细胞周期处于G0/G1期，无法继续进行细胞分裂，最终导致肺癌A549细胞凋亡。

本研究分析和评价了亚硒酸钠和白藜芦醇单独处理和联用对肺癌细胞拮抗的效果，通过比较单独处理和联用对A549细胞的细胞存活和凋亡、GSH、MDA、ROS的检测得出如下结论：与对照组相比，亚硒酸钠和白藜芦醇的联合降低了肺癌A549细胞的存活率，促进其凋亡；同时，亚硒酸钠和白藜芦醇的联合应用降低GSH的表达水平，增加MDA和ROS的表达水平。降低周期蛋白P-Rb的表达水平，阻滞细胞于细胞S期。通过研究亚硒酸钠和白藜芦醇联用对肺癌细胞的抗氧化性研究可以得出，亚硒酸钠和白藜芦醇的联用对肺癌细胞有抑制增殖、促进凋亡的作用。其机制可能与增加氧化损伤及降低P-Rb蛋白表达有关。