肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对BSA致大鼠肝纤维化的保护作用研究

张石蕾，由淑萍，赵 军，刘 涛，*

(1.新疆医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学护理学院基础护理学教研室，新疆 乌鲁木齐830011；3.新疆维吾尔族自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004)

近年来，化学及药理学研究显示，肉苁蓉苯乙醇总苷(Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一[1]。CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性，本课题组的前期研究发现，CPhGs对牛血清白蛋白诱导的肝纤维化大鼠有一定的预防和治疗作用[2]。有文献报道，CPhGs存在吸收差、口服利用度低等缺点，使其应用受到影响[3]。脂质体药物递送系统具有生物相容性良好，改善药物的稳定性、溶解性，增强药物疗效，降低给药频率的作用，近年来在基础及临床医学领域逐渐受到关注[4]。因此本文以脂质体为药物载体包裹中药成分CPhGs制成CPhGs脂质体，然后应用于肝纤维化模型动物考察CPhGs脂质体对肝纤维化大鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、 层 粘连蛋 白 (Laminin， LN)，透明质酸酶(Hyaluronidase，HA)，III型前胶原(Procollagen III，PC III)和 IV 型胶原(Collagen-IV，IV-C)含量的影响，肝脏组织胶原纤维分布情况的变化，胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和胶原蛋白III(Collagen III)mRNA表达含量的差异，以及α-平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin，α-sma)和Collagen Ⅰ蛋白表达水平的差异，阐明其对肝脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

牛血清白蛋白购于美国Sigma-Aldrich公司；谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒、谷草转氨酶(AST/GOT)测试盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠Hyaluronidase-1(HYAL1)ELISA Kit，大鼠laminin(LN)ELISA Kit购于武汉华美生物工程有限公司；大鼠PCⅢ(ProcollagenⅢ)ELISA Kit，Rat COL4(Collagen TypeⅣ)ELISA Kit购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Precision Plus ProteinTMDual Color Standards购于美国BIO-RAD公司；兔抗β-actin多克隆抗体、兔抗α-SMA多克隆抗体、兔抗CollagenⅠ多克隆抗体购于北京博奥森生物科技有限公司。

1.2 仪器

CK-40型荧光倒置显微镜购于日本Olympus公司；全波长自动酶联免疫反应检验测试仪购于美国Thermo Scientific公司；FluorChem E化学发光高灵敏凝胶成像仪购于美国Protein Simple公司；Zeta sizer Nano series ZS90粒径分析仪购于英国Malvern公司。

1.3 CPhGs脂质体的制备

采用薄膜分散法制备CPhGs脂质体。称取卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇(质量比为1∶2∶2)，溶于适量氯仿和甲醇混合溶剂中(体积比为2∶1)，在49～50℃下旋转使其成为膜状，加入250 μg/mL的CPhGs不断旋转水化，使磷脂膜转入水中形成脂质体，所得脂质体用0.45 μm的微孔滤膜挤压4～5次，0.22 μm的微孔滤膜挤压18～20次，真空冷冻干燥24 h，即得粒径均匀的苯乙醇总苷脂质体。使用激光粒度分析仪检测其粒径分布，在透射电镜下观察粒子外形，HPLC法测定其载药量及包封率。

1.4 实验动物、模型制备和给药

SPF级雄性健康SD大鼠，体质量180～220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(新)2018-0002。SPF环境实验动物使用许可证号SYXK(新)2018-0003，饲养受控环境条件为室温25℃、光/暗周期12 h，大鼠自由进食与饮水，喂饲标准颗粒饲料，常规适应性饲养3 d后使用。

65只SD大鼠随机分为2组，即正常对照组13只，BSA致敏模型组52只。模型组大鼠采用课题组前期[2]建立的方法制备大鼠免疫性肝纤维化模型，造模分为致敏阶段和尾静脉攻击阶段。致敏阶段：大鼠均多点皮下注射sc含BSA 9 g/L弗氏不完全佐剂，每次0.5 mL，共5次。前2次注射间隔为14 d，后3次注射间隔为7 d。末次致敏注射后1周，每只大鼠于眼内眦静脉丛采血，采用双向琼脂扩散法检测大鼠血清抗BSA抗体。攻击阶段：剔除模型组中4只未检测到BSA抗体的大鼠，余48只大鼠随机分为4组即模型组、空白脂质体组、肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组、肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组，每组12只，继续尾静脉注射BSA，每周2次，连续5周，注射剂量由每只2 mL逐渐递增至每只4 mL。正常对照组大鼠尾静脉注射生理盐水尾静脉攻击造模同时按设定剂量灌胃给药每日1次，肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组、肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组给予相当于肉苁蓉苯乙醇总苷原料药物量125 mg/kg灌胃受试物(剂量参照文献)[2]，正常对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，空白脂质体组按肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组脂质体的量给药。造模结束后继续给予受试物4周，每日1次，总实验周期共计15周。末次给药后，禁食不禁水，24 h后按3～4 mL/kg用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血，4℃放置2 h后以3 000 r/min离心10 min，留取血清待检；处死所有大鼠，迅速剖取肝脏相同部位组织，以生理盐水漂洗后，一部分用作组织病理学Masson染色，另一部分存于冻存管投于液氮并在-80℃条件下保存用作实时荧光定量PCR和Western blot检测。

1.5 血清生化指标检测

取大鼠血清样品采用微板法检测各组大鼠血清中ALT、AST浓度，ELISA法检测中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C浓度的变化。

1.6 Masson染色

切取肝脏中间部分肝组织(约1 cm3)用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成4～5 μm薄片，Masson染色，在光学显微下观察肝脏组织胶原纤维分布情况。

1.7 实时荧光定量PCR检测大鼠肝组织CollagenⅠ和CollagenⅢ mRNA表达的影响

分别取每只大鼠肝组织30 mg，经匀浆后用Trizol提取各组肝组织中的总RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR CollagenⅠ和CollagenⅢ mRNA检测，程序为：预变性95℃、30 s；变性95℃、3 s，退火60℃、30s，总共40个循环。引物由华大基因设计合成。CollagenⅠ：上游5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAA GAATG-3′，下游 5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCA C-3′。Collagen Ⅲ：上游 5′-GACACGCTGGTGCTCA AGGAC-3′，下游5′-GTTCGCCTGAAGGACCTCGTTG-3′。目的基因CT值经同一样本的内参基因校正后计算各组间每个基因的ΔCT，通过 2-ΔΔCT计算组间对应基因的表达差异。

1.8 Western blot检测大鼠肝组织α-sma和CollagenⅠ蛋白表达水平

分别取每只大鼠肝组织30 mg，经匀浆后用RIPA裂解液及离心处理，提取各组肝组织中的总蛋白，上样于聚丙烯酰胺凝胶进行还原性SDS-PAGE电泳，湿转(PVDF膜)，200 mA恒流电转90 min。封闭液(5%脱脂奶粉)封闭PVDF膜过夜，用1×TBST缓冲液充分振荡清洗，TBST稀释抗体，一抗稀释度为：α-sma，1∶ 5 000； Collagen Ⅰ ， 1∶ 5 000； β-actin， 1∶5 000。ECL显色。FluorChem E化学发光高灵敏凝胶成像仪上检测条带灰度值。

蛋白相对表达水平=目的条带灰度/β-actin条带灰度×100%

1.9 统计学分析

应用SPSS 16.0软件进行统计分析，各组数据结果以xˉ±s表示，计量资料采用方差分析，组间比较采用LSD法，等级资料采用秩和检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的物理性质

采用前述方法制得的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的粒径为(207.7±2.31)nm，Zeta电位为(-61.5±3.18)mV，图1～3分别为肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的透射电镜图像、粒度分布、Zeta电位分析图谱，可见表面有厚度均匀的包衣包裹，且粒度分布均匀。肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体载药量为(3.77±0.07)%，包封率为(37.2±0.30)%。

图1 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体透射电镜图像

图2 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体激光粒度仪粒度分布分析图谱

图3 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体Zeta电位分析图谱

2.2 大鼠肝功能生化指标变化

大鼠血清肝功能生化指标ALT、AST浓度的变化见表1，与正常对照组相比较，模型组大鼠血清ALT、AST浓度显著增加(P＜0.05)，且差异具有统计学意义；与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组均能显著降低模型大鼠血清ALT、AST浓度(P＜0.01)，空白脂质体组ALT、AST浓度下降不明显(P＞0.05)；与肉苁蓉总苷脂质体组比较，空白脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组ALT、AST浓度显著升高(P＜0.01)，差异具有统计学意义。

表1 Z各组大鼠血清肝功能生化指标ALT、AST浓度的变化(x±s)

2.3 大鼠血清LN、HA、PC III和IV-C浓度比较

大鼠血清LN、HA、PC III和IV-C浓度的比较见表2，与正常对照组相比较，模型组大鼠血清中LN、IV-C、HA、PC III浓度显著增加(P＜0.05)。与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组均能显著降低模型大鼠血清中LN、HA、PC III浓度(P＜0.01)，空白脂质体组LN、HA、PC III浓度无明显变化(P＞0.05)；与肉苁蓉总苷脂质体组相比较，肉苁蓉总苷原料药组血清中PC III浓度变化不明显(P＞0.05)，HA浓度显著增加(P＜0.01)，LN水平有所上升(P＜0.05)；与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组能显著降低大鼠血清中IV-C浓度(P＜0.01)，肉苁蓉总苷原料药组能降低大鼠血清中IV-C浓度(P＜0.05)；肉苁蓉总苷原料药组大鼠血清中IV-C浓度高于肉苁蓉总苷脂质体组(P＜0.01)。

表2 各组大鼠血清LN、HA、PC III、IV-C浓度的变化

2.4 大鼠肝组织Masson染色结果

Masson胶原染色结果见图4，显示正常对照组的大鼠肝组织并无明显的异常，未见炎细胞浸润，肝小叶构造清晰而完整，肝细胞呈条索状分布，未见有不规则血窦，汇管区无扩大，肝脏汇管区有极少量胶原纤维存在，肝小叶间未见纤维组织。与正常对照组相比较，模型组大鼠肝组织中纤维明显增多，分布广泛，可相互连接形成较粗大的纤维间隔，多位于汇管区和血管周围。肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组大鼠肝组织中胶原纤维明显减少，其中肉苁蓉总苷脂质体组组肝组织结构恢复良好，趋向正常，效果优于肉苁蓉总苷原料药组。

图4 各组大鼠肝组织Masson染色图(100×)

2.5 大鼠肝组织CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表达情况

qPCR检测结果见图5，显示模型组大鼠肝组织ECM调节因子(CollagenⅠ、CollagenⅢ)mRNA的表达水平较正常对照组大鼠肝组织明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组与模型组相比，CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA的表达水平显著降低(P＜0.01)，空白脂质体组较模型组无显著性差异；与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组肝组织CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表达水平显著升高(P＜0.01)。

图5 各组大鼠肝组织CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表达水平

2.6 各组大鼠肝组织α-sma和CollagenⅠ蛋白表达情况

Western blot检测结果见图6，显示与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织α-sma和CollagenⅠ蛋白的表达水平明显增加(P＜0.05)。与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组显著降低了肝组织α-sma和CollagenⅠ蛋白的表达，空白脂质体组α-sma和CollagenⅠ蛋白表达水平较模型组相比无显著性差异；与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组肝组织α-sma和CollagenⅠ蛋白的表达水平明显增加(P＜0.05)。

图6 各组大鼠肝组织α-sma和CollagenⅠ蛋白表达情况

3 讨论

肝纤维化是肝脏对各种慢性刺激进行损伤修复时发生的病理变化，其特征为细胞外基(extracellular matrix，ECM)合成增多而降解相对减少，导致其在肝内过多沉积[5]。目前抗肝纤维化的主要策略包括：治疗原发病，抑制ECM增生，促进ECM降解，抑制HSCs活化与诱导其凋亡[6]。

现代药理研究表明，肉苁蓉有润肠通便、保肝、抗骨质疏松、抗氧化、抗衰老、抗疲劳等作用[7]。其中起主要作用的一类成分便是苯乙醇苷类物质。但是有研究发现，苯乙醇总苷渗透性差，肠道吸收不良、体内生物利用度低，口服剂量(100 mg/kg)后大鼠血清中松果菊苷水平极低，绝对生物利用度仅为0.83%[8-9]。脂质体靶向递药系统能在病变局部形成相对较高的药物浓度，而脂质体就是其中一种重要的纳米微粒，可提高药物稳定性，增加药物的溶解度[10]。Zhu[11]等人研究发现，与高良姜素原料药相比，高良姜素脂质体能够更好地在CCl4致小鼠肝毒性方面起到保护作用。

本实验Masson染色结果显示，模型组大鼠纤维组织明显增生并向肝小叶内伸展，分布广泛，可相互连接形成较粗大的纤维间隔，肉苁蓉总苷脂质体组大鼠肝组织结构恢复良好，趋向正常，且效果优于肉苁蓉总苷原料药组。实验中损伤模型大鼠的血清AST、ALT均明显升高，肉苁蓉总苷原料药组、肉苁蓉总苷脂质体药物组对大鼠肝功能均有所改善，尤其以肉苁蓉总苷脂质体药物组的改善情况最为理想，较接近于正常组水平。肉苁蓉总苷脂质体组能够更有效的降低肝纤维化指标(LN、HA、PCⅢ、IV-C)，较其他组更接近于正常水平，但肉苁蓉总苷原料药组稍差。提示肉苁蓉总苷脂质体组能够改善肝纤维化大鼠的一般情况及肝功能，缓解肝脏纤维化程度，其作用强于相同剂量的肉苁蓉总苷原料药组，Masson染色结果也显示，肉苁蓉总苷脂质体组胶原沉积较原料药组有所减轻，说明肉苁蓉总苷脂质体组对抗肝细胞损伤作用比纯药有着明显优势，对肝脏保护，特别是对肝细胞保护有着确切的作用。

在肝纤维化初期，ECM主要成分由正常Ⅰ、Ⅳ型胶原为主转变为Ⅰ、Ⅲ型胶原所占比例增大[12]。当HSC被激活后，α-SMA表达大量增加，并附着于假小叶增生的纤维膈内，与HSC的活化、增殖、复制呈正相关，是HSC活化的特有标志物[13]。本实验研究结果显示，与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组大鼠肝组织α-sma和CollagenⅠ蛋白表达水平显著升高，提示可能是由于脂质体通过与靶细胞内吞、融合、释放和吸附过程，增加肉苁蓉总苷原料药体内稳定性，从而达到提高保肝作用。

综上可见，肉苁蓉总苷脂质体组具有更强的抗肝纤维化作用。能够使肝靶向性显著增强，从而达到更好的保护肝脏细胞的作用。无论从肝功能数据还是病理结果分析均显示肉苁蓉总苷脂质体组均优于肉苁蓉总苷原料药组对肝纤维化大鼠肝脏的保护。