邻苯二甲酸二丁酯的光敏毒性作用及机制

李志军，包海鹰*

（吉林农业大学药用菌物资源及开发利用重点研究室，食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118）

邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是邻苯二甲酸的酯化衍生物。作为塑化剂，PAEs被广泛应用于塑料、涂料、油墨的生产中，同时也可添加于驱虫剂、发胶喷雾剂、指甲油和火箭燃料中，但PAEs对人类健康具有严重危害[1]。PAEs是全球最普遍的环境激素类污染物，在食品、饮用水、人体体液中被不同程度检出[2]。美国国家环保局将PAEs列为环境优先污染物，同时其也被人们称为“第二个全球性多氯联苯污染物”。PAEs经口进入人体后主要以水解产生单酯的形式被吸收，单酯被认为是产生毒性的主要化合物。哺乳动物肠黏膜细胞中的肠酯酶及小肠中的细胞外膜可将PAEs水解成单酯[3]，如邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）进入体内后可水解为邻苯二甲酸单丁酯（mono-n-butylphthalate，MBP）。PAEs被吸收后主要以蛋白结合体的形式通过血液分布于全身各器官[4]。PAEs类化合物感染大鼠后，在大鼠肝脏、肾脏、心脏、肺、睾丸等各脏器中均可检出其原型及代谢产物，甚至还可以通过血脑屏障在脑组织中检出[5]。研究表明，MBP生物活性更高、毒性更强，其不仅对生殖、发育、体内激素、核受体、炎症和肥胖等方面都能产生影响，甚至还可以致死、致畸、致突变[6]；因此MBP成为PAEs毒性研究的新热点[7-11]。MBP灌胃染毒大鼠后，肝脏和肾脏中活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量较高，谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量较低。MBP的暴露与大鼠肝脏和肾脏组织的氧化损伤存在直接联系[12-13]。据Cao Yuchun[14]和白璐[15]等报道，在食用胶质菌中含有天然的PAEs类物质并具有光敏活性，但目前尚鲜见对DBP导致的光敏体内药代动力学及机制的研究。本研究以DBP为对象，从自由基损伤和肝脏、肾脏毒性角度探讨DBP的光敏毒性、致毒机制和体内代谢过程，以期为全面评价PAEs对人体健康的影响提供更丰富的信息，为全面了解PAEs毒性提供依据，为安全性评价和毒性机制的研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性Wistar大鼠（体质量200～220 g）购自吉林大学标准试验动物中心，生产许可证号：SCXK（吉）2016-0003。

DBP标准品、MBP标准品（纯度≥99.0%） 美国Sigma公司；甲基叔丁基醚（纯度≥99.0%） 国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸、三氯乙酸、氯仿（均为分析纯）、甲醇（色谱纯） 美国Tedia公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

2695型高效液相色谱仪 美国Waters公司；1K15高速离心机 美国Sigma公司；MVS.1漩涡混合器 北京北德科学器材有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；ME204E型万分之一天平梅特勒-托利多（常州）称重设备系统有限公司；电子轰击质谱仪 美国Thermo Fisher公司；电喷雾离子源浙江好创生物技术有限公司；RM2126RT切片机德国Leica公司；BX51光学显微镜（附带DP75数码相机） 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 DBP和MBP质量浓度的测定

色谱柱：C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：甲醇，流动相B：体积分数0.1%甲酸-水溶液。梯度条件：0～5 min，80%～95% A；5～9 min，95%～100% A；9～10 min，100% A；10～13 min，100%～80% A；13～15 min，80% A。流速：0.25 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

1.3.2 DBP体外实验

对6 只健康Wistar雄性大鼠眼眶取血10 mL，置于肝素化的离心管中，3 000×g离心15 min，吸取血清4 mL作为空白。分别取40 mg DBP溶于2 mL生理盐水和2 mL大鼠血清中，避光30 ℃放置12 h（避光组）；分别取40 mg DBP溶于2 mL生理盐水和2 mL大鼠血清中，置于日光下12 h（日光组）。3 000×g离心15 min，取血清0.2 mL，添加0.6 mL甲醇，漩涡振荡1 min，离心，上清液70 ℃下烘干，再用0.2 mL甲醇超声溶解，离心，微孔滤膜过滤。取上清液10 μL，按照1.3.1节方法测定DBP和MBP质量浓度。

1.3.3 DBP体内实验

1.3.3.1 DBP血药浓度的测定

对大鼠一次性给予2 000 mg/kgmbDBP灌胃染毒。对照组以等体积玉米油进行灌胃。分别设置避光组和日光组，避光组置于暗室中，调节暗室内温度与室外一致，日光组置于室外日光下，每组6 只大鼠。大鼠灌胃后分别于5、15、30、45 min和1、2、3、4、5、8、12、24、48 h眼眶取血0.8 mL，置于肝素化的离心管中，3 000×g离心15 min，取血清0.2 mL，添加0.6 mL甲醇，漩涡振荡1 min，离心，上清液70 ℃下烘干，再用0.2 mL甲醇超声溶解，离心，微孔滤膜过滤。取上清液10 μL按照1.3.1节方法测定DBP和MBP质量浓度。

1.3.3.2 MBP组织分布的测定

按1.3.3.1节方法对大鼠灌胃进行200 mg/kgmbMBP染毒。溶剂对照组以等体积玉米油进行灌胃。日光组和避光组分别设置为5、15、30、45 min和1、2 h组，每组6 只大鼠。各组大鼠经灌胃染毒后观察并记录体征变化。染毒结束后处死大鼠，分取肝脏、心脏、肺、肾脏和脾脏。脏器用生理盐水冲洗表面血迹，滤纸吸干，称质量，磨碎。用20 mL甲醇超声提取，取上清液1 mL，烘干，再用0.2 mL甲醇超声提取，离心，微孔滤膜过滤。取上清液10 μL按照1.3.1节方法测定MBP质量浓度。

1.3.3.3 脏器损伤相关指标的测定

按1.3.3.2节方法对大鼠进行灌胃染毒，日光组和避光组分别设置为5、15、30、45 min和1、2 h组，每组6 只大鼠。对大鼠进行眼眶取血，以灌胃染毒前采血样品为空白对照，离心10 min后吸出上层血浆，分别检测血浆中MDA、GSH、ROS含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力。随后取大鼠的部分肝脏和肾脏组织，先用预冷的磷酸盐缓冲液漂洗，然后称取适量组织，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.5），制成质量分数为10%的匀浆液，低温离心后取上清液，参考文献[13]测定ROS、GSH、MDA含量和SOD活力。

1.3.3.4 组织病理学变化观察

按1.3.3.2节方法对大鼠进行灌胃染毒，取大鼠部分肝脏和一侧的肾脏，用体积分数10%甲醛溶液固定，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，苏木精-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色，在光学显微镜下观察组织的病理学变化。

1.3.3.5 代谢样品的采集

取健康Wistar雄性大鼠12 只，随机分为避光组和日光组，每组各6 只。分置于代谢笼中，给药前禁食，实验期间自由进食与饮水。以2 000 mg/kgmbDBP给大鼠灌胃染毒。分别收集避光组与日光组给药前（空白）及给药后0～4、4～8、8～12、12～24 h各时间段的尿样和粪样，记录尿样体积，置于－80 ℃保存待测。

1.4 数据统计与分析

所有实验均重复3 次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析和简单相关性分析。用SIMCA-P 11.5软件对数据进行回归分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 DBP体外实验分析结果

图 1 MBP和DBP的液相色谱图Fig. 1 Liquid chromatograms of MBP and DBP

图1结果表明，DBP与血清混合后，在避光和日光下放置12 h均有MBP生成。但DBP与生理盐水混合后，在避光和日光下放置12 h均无MBP的生成。在空白血清中没有检测到MBP和DBP。对MBP进行分离，其电子轰击质谱图如图2所示。

图 2 MBP的电子轰击质谱图Fig. 2 Electron impact mass spectrum of MBP

2.2 DBP体内实验分析结果

图 3 DBP和MBP在大鼠体内的质量浓度变化Fig. 3 Changes in blood concentrations of DBP and MBP in rats

对大鼠单独灌胃1/10半数致死量的DBP后，DBP在大鼠体内的质量浓度变化见图3。随着时间的延长，DBP在大鼠血液中的质量浓度不断增加，在15 min左右避光组与日光组出现最大值，避光组为0.063 μg/mL，日光组为0.026 μg/mL；之后DBP质量浓度均下降，到3 h左右避光组出现第2个峰值（0.017 μg/mL）；同时，根据高效液相色谱分析结果，从大鼠血液中还检测到MBP。日光组大鼠在2 h左右全部死亡，其血液中的MBP质量浓度高于避光组大鼠，在2 h时达到0.133 μg/mL。避光组大鼠血液中的MBP质量浓度在1 h时出现最大值（0.054 μg/mL），之后趋于平稳，12 h后开始下降，24 h左右MBP质量浓度降到0.001 μg/mL。

2.2.2 MBP在大鼠体内的分布

大鼠灌胃DBP并在日光下照射2 h左右后出现急性中毒死亡，因此选择将组织分布实验时间设计在0～2 h。DBP灌胃大鼠后主要以水解产生MBP的形式被吸收，因此以MBP作为研究对象。图4结果表明，MBP灌胃大鼠后，避光条件与日光条件下，肝脏与肾脏中MBP质量浓度均高于脾、肺和心脏。肝脏和肾脏在避光条件与日光条件下MBP分布表现出较大差异：在避光条件下，肝脏中MBP质量浓度在45 min左右达到最大值（0.030 μg/mL），然后趋于平稳；肾脏中MBP质量浓度在45 min左右达到最大值（0.254 μg/mL），之后趋于平稳；日光组肝脏与肾脏中MBP质量浓度均在30 min左右达到最大值，肝脏中为0.048 μg/mL，肾脏中为0.043 μg/mL，之后MBP质量浓度先下降后趋于平稳。

图 4 MBP在大鼠体内的分布Fig. 4 Distribution of MBP in rats

2.2.3 脏器损伤相关指标的测定

表 1 MBP对大鼠肝脏中ROS、MDA、GSH含量和SOD活力的影响Table 1 Effect of DBP on ROS, MDA, GSH and SOD levels in rat liver

由表1、2可见，与空白对照组相比，避光组和日光组大鼠肝脏和肾脏中的ROS和MDA含量均升高，但灌胃30 min后日光组ROS含量明显高于避光组。避光组和日光组大鼠肝脏和肾脏中GSH含量和SOD活力均降低，但灌胃15 min后日光组明显低于避光组。

表 2 MBP对大鼠肾脏中ROS、MDA、GSH含量和SOD活力的影响Table 2 Effect of DBP on ROS, MDA, GSH and SOD levels in rat kidney

2.2.4 大鼠肝脏组织切片观察结果

图 5 大鼠肝脏组织HE染色结果（×100）Fig. 5 Hematoxylin eosin staining of liver tissue（× 100）

以200 mg/kgmbMBP灌胃后，在显微镜下观察经HE染色的大鼠肝脏组织细胞时发现，肝细胞的损伤程度与光照时间存在明显的时间-效应关系，大鼠肝细胞在日光下2 h损伤最明显。由图5可看出，避光组灌胃MBP后5 min～2 h内，肝脏细胞均以中央静脉为中心向外呈辐射状排列，肝窦状隙规则分布且细胞排列较为密实，肝脏细胞损伤不明显（图5A～D）。日光组在灌胃MBP后30 min左右肝细胞局部伴随轻微炎症细胞浸润、细胞核轻微固缩、局部胞浆空亮和局部细胞肿大等症状；随着时间的延长，在1 h左右出现部分肝细胞水肿、细胞核固缩、破裂、水解症状；2 h左右肝细胞出现胞浆空亮、核消失、空泡样变、脂肪滴增大融合、局部细胞严重坏死症状，说明肝细胞存在严重的氧化损伤（图5E～H）。因此，在日光下MBP对大鼠肝脏的损伤程度高于避光条件。

2.2.5 大鼠肾脏组织切片观察结果

丹皮酚对强直性脊柱炎模型小鼠Wnt和BMP/Smad信号转导通路的影响 ………………………………… 吴 琪等（11）：1500

图 6 大鼠肾脏组织HE染色结果（×100）Fig. 6 Hematoxylin eosin staining of kidney tissue（× 100）

显微镜下观察大鼠肾脏组织切片时发现，与肝脏组织细胞相比，日光组大鼠肾脏组织细胞同样发生了严重的组织损伤。灌胃MBP后，避光组大鼠（图6A～D）出现了局部肾小管上皮细胞脱落、水样变性等症状，但大鼠肾脏病理切片可见肾皮质和髓质结构清晰，系膜区无增生及沉积物，基底膜未见病变；随着时间的延长，在2 h左右细胞肾小囊管腔变窄，出现炎症细胞浸润等症状。日光组大鼠（图6E～H）灌胃MBP后1 h左右，出现了肾小体数目减少、肾小囊管腔变窄、淋巴细胞浸润程度增大等症状，且损伤程度明显高于避光组。结果表明日光能够加重MBP对大鼠的肾脏损伤。

2.2.6 DBP对大鼠排泄的影响

大鼠灌胃DBP后，其主要以MBP的形式从尿液中排泄，且在尿液中没有检测到DBP，避光组0～4 h时尿液中MBP质量浓度为0.427 μg/mL，4～8 h时为0.164 μg/mL，8～12 h时为0.455 μg/mL，12～24 h时为0.560 μg/mL。日光组0～4 h时尿液中MBP质量浓度为0.132 μg/mL，4～8 h时为0.069 μg/mL，8～12 h时为0.291 μg/mL，12～24 h时为0.099 μg/mL。在0～24 h内，避光组大鼠尿液中MBP质量浓度高于日光组（图7A）。MBP和DBP在大鼠粪便中均被检出（图7B），且0～24 h内避光组大鼠粪便中DBP和MBP质量浓度均大于日光组。结果表明与日光组相比较，避光组大鼠体内DBP更容易代谢排出体外。

图 7 大鼠排泄物中DBP、MBP的质量浓度变化Fig. 7 Changes in urinary and fecal concentrations of DBP and MBP in rats

3 讨 论

PAEs是全球最普遍的环境激素类污染物，其中DBP是我国最常使用的增塑剂之一，其可通过饮食摄入、呼吸道吸入和皮肤接触等途径对人体造成危害[16]，可导致过敏性皮炎[17]以及生殖[18]、神经、肝脏、肾脏和心脏等多种器官系统的损伤[17-23]。DBP导致肝细胞过氧化物酶增多、肝肿大的问题曾引起专家的重视，尽管该作用机制还不是十分明确，但是过氧化物酶增生和肝肿大通常发生在肿瘤形成之前[24]。近年来，有研究者通过测量尿液中DBP代谢物MBP的含量来间接反映DBP的接触水平，基于样品的易得到性和检测方法的成熟性，认为MBP是一种较合适的反映DBP暴露的生物标志物[25]。

本实验应用对比研究，结合多元统计分析方法，对DBP的光敏毒性进行研究，旨在找出DBP与光照的关联性以及DBP在光照下毒性加剧的机理，从整体上阐明光照条件对大鼠的毒性作用及代谢调控机制。本研究采用高效液相色谱法检测了在光照和避光条件下大鼠体外、体内血清中DBP和MBP的质量浓度。体外血清实验结果表明DBP在大鼠血清中转化为MBP，与是否光照无关。因此，对于MBP在日光下是否会加剧对大鼠的毒性作用以及机理进行研究。大鼠代谢实验中，经口灌胃DBP，其可迅速经胃肠道吸收，经小肠内的非特异性酶代谢成稳定的MBP，MBP和其他代谢产物与葡糖普酸结合后随尿液排出[3]。大鼠经口给予MBP后，在心脏、肝脏、脾、肺和肾脏中均能检测到DBP，但肝脏和肾脏中MDP质量浓度明显高于其他脏器。

Jurczuk等的研究表明，ROS超过一定浓度时会对其他生物分子产生不利影响[26]，因此ROS的生成和氧化应激反应是MBP造成肝脏和肾脏炎症的主要方式。在灌胃MBP后，日光组大鼠的肝脏和肾脏组织GSH含量下降，这可能是由于MBP持续氧化产生应激产物ROS所引起，同时GSH由于去除过氧化氢而被消耗。王立蓉等研究表明，细胞GSH含量降低到一定程度时，细胞会受到不可逆损伤[27]。MDA在机体的新陈代谢过程中发挥重要作用，可以造成膜的流动性与通透性的改变，导致异常生理生化反应与免疫反应的产生。SOD可以保护细胞不受氧自由基的损伤，能够清除H2O2和·OH。当MDA含量升高、SOD活力降低时，可以引发氧化应激反应，从而损伤细胞甚至导致某些细胞的死亡[28]。对染毒大鼠肝脏和肾脏中关键指标进行测定，结果表明，ROS和MDA的含量与MBP染毒后光照时间呈正相关，GSH含量和SOD活力与MBP染毒后光照时间呈负相关；相同剂量MBP染毒后，与避光组相比，日光组大鼠血清中ROS和MDA含量较高，GSH含量和SOD活力较低，表明光照能加剧MBP对大鼠肝脏和肾脏组织的氧化损伤。

肝脏和肾脏的HE染色病理切片观察结果表明，染毒后随着时间的延长，日光组大鼠肝细胞和肾小管上皮细胞出现明显的细胞核固缩、细胞水肿、空泡样变、脂肪滴增大融合等症状，而避光组损伤程度相对较轻，结果表明日光能够加剧MBP对大鼠肝脏和肾脏的组织损伤。大鼠排泄物的研究结果表明，光照条件较避光条件下MBP在大鼠体内更不易排出体外。说明DBP是一种对雄性大鼠具有潜在危害的光敏毒性物质。

DBP可通过食物、饮水等多种途径被人体摄入[29]。张鹏等研究表明，在胶陀螺中含有一定量的天然DBP[30]，且近年来更有胶质菌食用不当而引发的急性中毒事件的报道[31]。李志军等研究表明，不同的浸泡方式对黑木耳中DBP含量存在相关性[32]，胶质菌的急性中毒事件可能与胶质菌中存在的DBP有关。本研究证明了DBP的光敏毒性和在体内脏器中的分布规律，应重视DBP对人体的潜在危害，并对DBP及含有天然DBP食品的健康危险度做出更全面的评价。