超高压对带鱼鱼糜凝胶特性及其肌原纤维蛋白结构的影响

陈燕婷，林 露，高 星，罗华彬，张进杰，楼乔明，徐大伦，杨文鸽*

（宁波大学食品与药学学院，浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315211）

带鱼（Trichiurus haumela）是我国主要的海产经济鱼类，年捕获量约110万 t，尤其在浙江省，带鱼捕捞量约占全国总量的40%[1]。目前市场上的大规格带鱼往往直接鲜销或加工成冷冻品，而大量小规格带鱼多用于制备鱼糜，以缓解海水鱼糜加工原料不足的问题。但由于带鱼肉脂肪含量较高，盐溶蛋白含量相对较低，所制得的鱼糜凝胶强度较低、色泽较差，带鱼鱼糜的凝胶品质有待改善[2-4]。鱼糜凝胶品质与其凝胶化方式密切相关，目前鱼糜凝胶化主要以热处理为主，但在改善鱼糜凝胶品质方面，通过热诱导形成凝胶的加工方法仍不够理想。

作为一种非热加工技术，超高压处理具有杀菌、钝化酶活力和延长食品保质期等作用[5]，同时超高压会改变蛋白质等生物大分子的空间结构，导致蛋白质变性、凝胶化[6-7]，在合适的压力和保压时间下，能提高食品蛋白的凝胶形成能力[8]。Ma Xingsheng[9]、Ma Fei[10]等研究表明，超高压处理可改善肉类盐溶蛋白凝胶的质构特性和持水性，其发现六齿金线鱼鱼糜经400 MPa处理10 min，其破断力和持水率均显著高于热处理组，并形成了致密、均一的网络结构，凝胶特性明显改善；马海建等[11]发现超高压处理有利于草鱼鱼糜凝胶品质的提升，且在340 MPa、保压12 min后鱼糜的凝胶强度和质构特性总体达到最佳。

本实验以带鱼鱼糜为原料，通过预实验筛选到几组较合适的超高压处理参数，并进一步研究超高压处理对鱼糜凝胶质构、白度、凝胶强度、微观结构及其肌原纤维蛋白含量的影响，确定合适的超高压处理条件，同时结合圆二色光谱（circular dichroism，CD）分析肌原纤维蛋白构象单元组成，探讨超高压诱导鱼糜凝胶的形成机制，旨在为超高压技术在鱼糜及其制品加工中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻带鱼鱼糜（－20 ℃冻藏） 宁波飞日水产实业有限公司；食盐（食品级） 宁波市盐业有限公司；聚偏二氯乙烯肠衣（食品级，直径25 mm） 南通皇佳肠衣有限公司。

叔丁醇、戊二醇、无水乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ML104/02型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UMC 5型真空斩拌机 德国Stephan Machinery公司；CQC2L-600超高压设备 北京速原中天股份有限公司；TA.XT Plus质构分析仪 英国Stable Micro Systems 公司；CR-400色差计 日本Konica Minolta公司；S-3400N型扫描电子显微镜 日本日立公司；Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机 德国Thermo Scientific Sorvall公司；SpectraMax i3多功能酶标仪美国Molecular Devices公司；J-1500-150 CD仪 日本分光株式会社。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

带鱼鱼糜4 ℃解冻，置于真空斩拌机空斩2 min，加冰水调节水分质量分数至80%，添加质量分数2.5%食盐后继续擂溃8 min，全程温度控制在10 ℃以下。将斩拌后的鱼糜灌入直径为25 mm的肠衣中，得到长度约100 mm的鱼肠，两头扎紧。

鱼肠经超高压处理形成凝胶为超高压诱导组，超高压条件：350 MPa下分别保压5、8 min，400 MPa下保压5、6.5 min和8 min，分别记为350-5、350-8、400-5、400-6.5、400-8；鱼肠经二段加热（40 ℃加热60 min后90 ℃加热30 min）形成凝胶为热诱导组，记为H；未处理的鱼肠为对照组，记为C。各组鱼肠处理后，冰水迅速冷却，4 ℃保存，取样测定各项指标。

1.3.2 质构指标的测定

将鱼肠平衡至20 ℃，去肠衣，切成25 mm高的柱体。使用P/50探头，进行质构分析（texture profile analysis，TPA）。测试参数为：预压速率1.0 mm/s、下压速率5.0 mm/s、回复速率1.0 mm/s、感应力5 g、压缩比50%，用仪器自带软件TPA.MAC处理结果。

1.3.3 凝胶强度的测定

参考Kudre等[12]方法，并略作修改。将鱼肠切成25 mm小段，质构仪测定鱼糜凝胶强度。测定参数为：压缩力模式、P/0.5S球形探头、测前速率1.0 mm/s、测中速率1.0 mm/s、测后速率10 mm/s、压缩比50%。

1.3.4 凝胶白度的测定

色度分析前，用标准白板校正色差仪。每个鱼肠样品测量3 个不同部位，结果取平均值，白度为L*（明亮度）、a*（红绿偏差）和b*（黄蓝偏差）值的综合指标，按照下式计算。

1.3.5 凝胶微观结构的观察

将鱼肠切成约1 mm3小块，体积分数2.5%戊二醛溶液固定凝胶，24 h后用磷酸缓冲液（0.1 mol/L、pH 7.2）漂洗3 次，依次用体积分数30%、40%、50%、70%、80%、90%乙醇及无水乙醇梯度洗脱，随后按V（无水乙醇）：V（叔丁醇）＝3∶1、1∶1、1∶3比例及纯叔丁醇依次洗脱，最后用少量叔丁醇覆盖样品，冷冻干燥，贴样、镀金后用于扫描电子显微镜观察，加速电压为15 kV。

1.3.6 肌原纤维蛋白提取及含量测定

参考Xiong Guangquan等[13]方法。取2 g鱼肠样品于离心管中，加10 倍体积20 mmol/L Tris-马来酸缓冲液（含0.05 mol/L KCl，pH 7.0），充分匀浆，离心（10 000 r/min、10 min），沉淀加入10 倍体积20 mmol/L Tris-马来酸缓冲液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0），充分匀浆，静置提取1 h后10 000 r/min离心10 min，上清液即为肌原纤维蛋白溶液。以上操作均在2～4 ℃下进行，采用福林-酚法测定肌原纤维蛋白含量。

1.3.7 肌原纤维蛋白二级结构的测定

采用CD仪，选用光径为0.1 cm的石英样品池，在远紫外区（190～250 nm）对0.2 mg/mL肌原纤维蛋白溶液进行扫描，扫描速率为50 nm/min，0.25 s响应，测定温度25 ℃。根据CD谱图，通过仪器自带软件计算出肌原纤维蛋白分子中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲结构的相对含量。圆二色性用平均残基椭圆度[θ]表示，单位为deg/（cm2·dmol）。

1.4 数据处理与分析

实验平行3～5 次，数据取平均值±标准偏差表示，采用Origin 9.0软件绘图，采用SPSS 21软件单因素方差分析中的Duncan法检验差异显著性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对鱼糜质构特性的影响

图1显示了带鱼鱼糜的质构特性随处理条件的变化。与对照组和热诱导组相比，超高压处理使带鱼鱼糜的硬度、咀嚼性显著上升（P＜0.05），黏聚性和弹性显著优于对照组（P＜0.05），但略低于热诱导组。这可能是因为超高压处理使鱼糜体积缩小，有助于鱼糜蛋白之间化学键和疏水作用力的形成，使结构更加紧凑，表现出更佳的内聚性与弹性，形成硬度和咀嚼性更好的凝胶网状结构[14]。

图 1 超高压对鱼糜凝胶强度的影响Fig. 1 Effect of UHP on the gel strength of surimi

当压力为350 MPa时，350-8组鱼糜凝胶的硬度、咀嚼性和黏聚性均显著高于350-5组（P＜0.05）；但当压力为400 MPa时，硬度、咀嚼性和弹性随加压时间延长呈现先下降后上升的变化趋势，黏聚性呈下降的趋势。不同鱼糜由于原料特性的差异，压力和保压时间对其凝胶质构特性的影响不同。余辉等[15]测定鼬鳚鱼糜-大豆分离蛋白复合物时发现，压力小于300 MPa时，硬度、弹性、咀嚼性均随着压力升高而逐渐增大，继续升高压力，硬度反而显著减小，而弹性、内聚性和咀嚼性则无显著变化。这与马海建等[11]研究的草鱼鱼糜制品质构特性的影响相似。胡飞华[16]用400 MPa保压10 min获得最优的梅鱼鱼糜质构特性，且明显优于热处理组。

2.2 超高压处理对鱼糜凝胶强度的影响

图 2 超高压对鱼糜凝胶强度的影响Fig. 2 Effect of UHP on the gel strength of surimi

凝胶强度是较为重要的凝胶性能指标，如图2所示，相比于对照组，热诱导处理能显著提高鱼糜的凝胶强度，超高压处理效果又显著高于热诱导组（P＜0.05）。在超高压诱导组中，除400-5组外，其余4 组鱼糜凝胶强度没有显著差异（P＞0.05），其中350-8组凝胶强度最高。马海建等[11]研究表明，超高压处理可明显提升鱼肠的凝胶形成能力，300 MPa下鱼肠的凝胶强度达到最高。超高压处理提高鱼糜的凝胶强度，一方面可能是由于超高压抑制了鱼糜内源性蛋白酶的活性，另一方面超高压诱导蛋白质变性，导致巯基氧化形成二硫键，疏水性氨基酸暴露于分子表面[17]，而二硫键和疏水相互作用是维持鱼糜凝胶网络结构的主要作用力，超高压通过增强鱼糜蛋白之间二硫键和疏水相互作用力的形成，促进鱼糜凝胶形成，提高鱼糜凝胶强度[18-19]。

2.3 超高压处理对鱼糜白度的影响

表 1 超高压处理对鱼糜白度的影响Table 1 Effect of UHP on the whiteness of surimi

不同处理条件下带鱼鱼糜白度的变化见表1。与对照组相比，超高压和热处理均能显著增加鱼糜白度、L*值，但热诱导组增加更为明显；对a*值和b*值，超高压和热处理的影响恰好相反，超高压导致鱼糜a*值和b*值下降，而热处理后a*值和b*值显著增加（P＜0.05）。在相同的压力下，保压时间延长，a*值逐渐减小，而b*值没有明显的变化规律。超高压和热处理后鱼糜白度、L*值增加，原因在于高压或加热均能诱导鱼糜形成凝胶，凝胶三维网络结构能截留更多的水分从而减少光的散射[20-21]。Tabilo-Munizaga等[22]发现，超高压显著改善太平洋鳕鱼鱼糜凝胶的白度，并认为超高压引起鱼糜凝胶色泽变化的原因可能是压力作用下肌红蛋白中球蛋白发生变性，或肌红蛋白中的亚铁血红素被取代或失去，导致a*值下降、L*值增加。根据优质鱼糜凝胶标准[23-24]，即高亮度、低黄度、高白度，350-8、400-8组结果比较合适。

2.4 鱼糜凝胶微观结构的分析

通过扫描电子显微镜放大10 000 倍观察，可看出超高压组、热诱导组鱼糜凝胶与对照组鱼糜的结构有明显不同。对照组鱼糜尚未形成凝胶网络结构；而热诱导组鱼糜的凝胶网络结构致密且均匀，交联度较高；经超高压处理后，鱼糜均形成了一定的凝胶网络结构。与350-5组相比，350-8组凝胶网络结构更为紧密；400 MPa处理组中，400-5组的凝胶网络结构较为紧密，交联程度高，400-6.5组和400-8组的凝胶网络结构变得较疏松，交联度有所下降。这是由于在适宜条件的超高压处理后，鱼糜蛋白之间由于疏水、静电及氢键相互作用的改变，导致其发生聚集和交联，蛋白质即开始出现网状结构[25]，但压力过大会使网状结构发生破坏[26-27]。仪淑敏等[28]研究金线鱼鱼糜亦有类似结论。总体上，带鱼鱼糜经350 MPa处理8 min，其凝胶网络微观结构与热诱导组接近，这与其凝胶的质构特性、白度的结果一致。

图 3 不同处理条件下的鱼糜凝胶微观结构Fig. 3 Effect of UHP on the microstructure of surimi gel

2.5 超高压处理对鱼糜肌原纤维蛋白含量的影响

图 4 超高压处理对鱼糜肌原纤维蛋白含量的影响Fig. 4 Effect of UHP on the content of myofibrillar proteins in surimi

由图4可以看出，超高压和热处理均引起肌原纤维蛋白含量显著下降，其中热诱导组肌原纤维蛋白含量下降最为显著（P＜0.05）。同加热能引起蛋白变性相似，Tan等[29]认为高压通过影响蛋白质分子间的相互作用键（氢键、疏水相互作用、静电力），能够导致蛋白质变性、聚集或凝集；李仁杰等[30]指出超高压通过压缩蛋白质分子体积，改变其非共价键，引起蛋白质解聚、分子结构伸展等变化；周果等[31]认为当压力大于250 MPa时，过高的压力会导致蛋白变性，变性蛋白的盐溶能力下降，因此肌原纤维蛋白含量降低。

2.6 超高压处理对肌原纤维蛋白构象的影响

不同处理条件下，鱼糜肌原纤维蛋白的CD见图5，其二级结构单元的相对含量如图6所示。由图5可知，对照组鱼糜肌原纤维蛋白在209 nm和220 nm附近两个负峰明显，表明有丰富的α-螺旋构象单元。经超高压或热处理，鱼糜肌原纤维蛋白CD谱中的两个负槽逐渐消失，说明α-螺旋含量有所降低。王玮等[32]发现超高压处理降低了酶蛋白二级结构中α-螺旋的比例，但秦影等[33]研究表明超高压处理的大黄鱼鱼糜凝胶蛋白中α-螺旋含量显著增加，无规卷曲和β-转角含量显著下降，β-折叠含量无明显变化，可见不同原料蛋白对超高压的敏感程度不一，由此产生不同程度的构象变化。

图 5 超高压处理对鱼糜肌原纤维蛋白CD谱图的影响Fig. 5 Effect of UHP on the CD spectrum of myofibrillar proteins in surimi

图 6 超高压处理对肌原纤维蛋白二级结构相对含量的影响Fig. 6 Effect of UHP on the relative content of secondary structure in myofibrillar proteins

结合图6可知，与对照组相比，超高压和热处理均对肌原纤维蛋白的构象单元组成产生影响，其中α-螺旋相对含量下降，无规卷曲相对含量上升，说明在凝胶化过程中鱼糜蛋白紧密的螺旋结构向无规则状态转变。在5 组超高压处理组中，350-8组鱼糜凝胶中的肌原纤维蛋白有更多的无规卷曲和更少的β-折叠结构，而各组α-螺旋相对含量基本接近；随着所加压力由350 MPa增大至400 MPa，肌原纤维蛋白β-折叠相对含量增加，无规卷曲相对含量下降，说明压力的增加并不利于鱼糜蛋白向无规则状态转变。热诱导组肌原纤维蛋白中的α-螺旋相对含量最低（16.68%），β-折叠（33.55%）及无规卷曲（43.08%）相对含量较高，超高压处理组中，350-8组肌原纤维蛋白的无规卷曲相对含量接近热诱导组，这与其凝胶微观结构最接近热诱导组一致。

3 结 论

超高压和热处理均能提升带鱼鱼糜的质构、凝胶强度、白度，并且形成一定的凝胶网络结构，从而改善鱼糜凝胶品质。不同条件的超高压（350-5、350-8、400-5、400-6.5、400-8）处理，其鱼糜凝胶的白度较热诱导组低，但质构、凝胶强度及肌原纤维蛋白含量均优于热诱导组，可用于诱导鱼糜凝胶化反应。尤其是经350 MPa处理8 min，鱼糜质构、凝胶强度及白度均优于其他超高压诱导组，其凝胶网络微观结构与热诱导组接近。同时，超高压和热处理均引起肌原纤维蛋白含量显著下降，鱼糜肌原纤维蛋白CD谱中的两个负峰逐渐消失，α-螺旋相对含量有所降低，其中热诱导组下降最为显著。超高压诱导组中，350-8组肌原纤维蛋白的无规则卷曲相对含量最高，并与热诱导组接近，认为在凝胶化过程中鱼糜蛋白紧密的螺旋结构向无规则状态转变。可见，超高压处理可以作为改善鱼糜凝胶品质的有效手段，就带鱼鱼糜而言，合适的超高压处理条件为350 MPa处理8 min。