醇溶性栀子红色素衍生物的制备及稳定性研究

刘国荣 郜亚昆 辛梦娜 李雯晖 赵世博 刘 亚 王成涛* 孙宝国

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京市食品添加剂工程技术研究中心北京工商大学 北京100048 2 天津市和平区市场监督管理局 天津300041 3 云南中烟工业有限责任公司技术中心 昆明650202）

栀子红色素是一种天然红色素，是由栀子果实中的京尼平苷经脱酯、酸化、β-葡萄糖苷酶水解后生成的京尼平苷酸苷元与伯胺化合物显色生成[1-2]，易溶于水和30%以下的乙醇水溶液，呈鲜艳紫红色。现有的栀子红色素不溶于无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚等有机试剂和油脂。多名研究学者对栀子红色素进行了稳定性研究，发现其对高温、光均比较稳定，而对还原剂稳定性较差，易分解褪色，限制了其应用[3-4]。目前栀子红色素在我国尚不允许作为食品添加剂使用，而在欧盟、日本、美国等国家允许使用，在日本有近40年的食用历史，可广泛应用于饮料、面点、甜酒、馅心、赤豆饭等[5-6]。

化学改性法是针对色素已有的官能团采用化学反应的方法增加基团，从而改变色素的性质，改变色素的溶解性并提高稳定性[7-10]。利用化学改性法可封闭栀子红色素中的亲水基团-OH，降低其分子极性，扩大其溶解范围。

本研究采用乙酸酐酯化法制备醇溶性栀子红色素衍生物，利用单因素逐级试验确定其最佳工艺条件；分析其溶解性和不同条件下的稳定性，评价化学改性法提高扩大栀子红色素溶解性、稳定性的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水溶性栀子红色素，河南中大生物工程有限公司；乳酸、乙酸酐、浓盐酸、无水乙醚、无水乙醇、丙酮、石油醚、二甲基亚砜、三氯甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、氯化钠、氯化铝、硫酸铜、氯化铁、硫酸亚铁，均为国产分析纯级试剂。

1.2 主要仪器与设备

电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV 2450 型紫外分光光度计，日本岛津公司；IKA RCT 基本型磁力搅拌器，德国艾卡公司；pH 400 型台式pH 计，安莱立思仪器科技有限公司；CM-3610A 型色差仪，日本柯尼卡美能达公司；高速离心机，北京天林恒泰科技有限公司；SHZ-A 水浴恒温振荡器，上海博迅实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 栀子红色素衍生物的制备 称取适量水溶性栀子红色素于锥形瓶中，加入一定体积乳酸充分溶解色素，按一定比例加入乙酸酐，加入几滴浓盐酸作为催化剂，在一定温度下匀速搅拌反应一定时间，冷却至室温，离心取上清（10 000 r/min，10 min），向上清液中加入一定量无水乙醚，离心取沉淀（10 000 r/min，10 min），于40 ℃烘箱中烘干至恒重，得到栀子红色素衍生物。

1.3.2 栀子红色素衍生物制备工艺条件的优化影响栀子红色素衍生物制备的主要因素有：料液比、反应时间、反应温度等。以栀子红色素衍生物的产量为考察指标进行单因素逐级试验，确定影响包合物形成的主要因素。

1.3.2.1 不同料液比对栀子红色素衍生物产量的影响 准确称取1.0 g 水溶性栀子红色素于锥形瓶中，加入20 mL 乳酸充分溶解，分别加入5，10，15，20，25，30 mL 乙酸酐，加入5 滴浓盐酸作为催化剂，在室温（25 ℃）下匀速搅拌反应4 h，离心取上清（1 0000 r/min，10 min），向上清液中加入40 mL 无水乙醚，离心（10 000 r/min，10 min）取沉淀，干燥，称量。

1.3.2.2 不同反应时间对栀子红色素衍生物产量的影响 准确称取1.0 g 水溶性栀子红色素于锥形瓶中，加入20 mL 乳酸充分溶解，加入20 mL乙酸酐，再加入5 滴浓盐酸作为催化剂，在室温（25 ℃） 下分别匀速搅拌反应1，2，3，4，5，6 h，离心（10 000 r/min，10 min）取上清，向上清液中加入40 mL 无水乙醚，离心（10 000 r/min，10 min）取沉淀，干燥，称量。

1.3.2.3 不同反应温度对栀子红色素衍生物产量的影响 准确称取1.0 g 水溶性栀子红色素于锥形瓶中，加入20 mL 乳酸充分溶解，加入20 mL乙酸酐，再加入5 滴浓盐酸作为催化剂，分别在20，30，40，50，60，70，80，90 ℃下匀速搅拌反应4 h，离心（10 000 r/min，10 min）取上清，向上清液中加入40 mL 无水乙醚，离心（10 000 r/min，10 min）取沉淀，干燥，称量。

1.3.3 栀子红色素衍生物的特征吸收波长检测分别称取0.1 g 的水溶性栀子红色素和栀子红色素衍生物粉末，分别用超纯水和无水乙醇溶解，稀释适当倍数，分别以超纯水、无水乙醇作参比，采用紫外-可见分光光度计（UV-Vis）测定色素溶液400～700 nm 区间内的紫外-可见吸收光谱，确定栀子红色素衍生物的最大吸收波长（λmax）。

1.3.4 栀子红色素衍生物的溶解性 分别称取一定质量的水溶性栀子红色素和栀子红色素衍生物，加入等体积的各种溶剂中，考察色素的溶解性。

1.3.5 色素色价与色调的测定

1.3.5.1 色素色价的测定 准确称取0.1 g 栀子红色素衍生物粉末，用无水乙醇溶解，稀释适当倍数，以无水乙醇作参比，采用紫外-可见分光光度计测定其λmax处的吸光值。参考徐尤智等[11]的测定方法，代入下式计算色价：

1.3.5.2 色素色调的测定 取适量色素溶于无水乙醇中，稀释至最大吸收波长下的吸光值A=0.65，用色差仪测定色调参数[12]。测定条件：照明光源D65，视角10°。测定参数：L*，a*，b*。其中，L*值表示溶液的亮度，L*值越大，溶液的亮度越高；a*值表示溶液的颜色红/绿程度，a*为正值且越大溶液颜色越红，a*为负值且越小溶液颜色越绿；b*值表示溶液的颜色黄/蓝程度，b*为正值且越大溶液颜色越黄，b*为负值且越小表示溶液颜色越蓝。

1.3.5.3 色素色差的计算 根据色素的色调（L*，a*，b*）计算色素在不同条件下放置一段时间后的色差，计算公式[12-13]：

明度差：ΔL*=LS*-LT*

红/绿差：Δa*=aS*-aT*

黄/蓝差：Δb*=bS*-bT*

式中，下标S 和T 分别表示样品色和标准色。

1.3.6 色素残留率的测定 色素残留率计算公式：

式中，A后——试验结束后的憎水性栀子蓝色素衍生物溶液在λmax处的吸光值；A前——试验前的憎水性栀子蓝色素衍生物溶液在λmax处的吸光值。

1.3.7 栀子红色素衍生物的稳定性

1.3.7.1 光照稳定性 将栀子红色素衍生物粉末溶于无水乙醇中，调吸光值A=0.65，分别在阳光照射（40 000 lux）、灯光直射（13 000 lux）、室内散射（300 lux）和阴暗避光（对照）4 种条件下放置6 d，每天取样测量色素溶液的吸光值及色调，计算色素残留率与色差。

1.3.7.2 热稳定性 将栀子红色素衍生物粉末溶于无水乙醇中，调吸光值A=0.65，分别在25（室温），40，60，80，100 ℃5 种条件下避光放置4 h，每1 h 取样测量色素溶液的吸光值及色调，计算色素残留率与色差。

1.3.7.3 pH 稳定性 将栀子红色素衍生物粉末溶于无水乙醇中，调吸光值A=0.65，以色素原液为对照，分别在pH=3，4，5，7，9，11，13 7 种条件下避光放置24 h，在2，4，8，24 h 取样测量色素溶液的吸光值及色调，计算色素残留率与色差。

1.3.7.4 金属离子稳定性 将栀子红色素衍生物粉末溶于无水乙醇中，调吸光值A=0.7，配制0.01 mol/L 的Ka+、Ca2+、Na+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Cu2+溶液，将色素溶液与金属离子溶液9∶1（V∶V）混合，对照为色素溶液与乙醇9∶1（V∶V）的混合溶液，避光放置24 h，分别在2，4，8，24 h 取样测量色素溶液的吸光值及色调，计算色素残留率与色差。

1.3.7.5 氧化-还原稳定性 将栀子红色素衍生物粉末溶于无水乙醇中，调吸光值A=0.7，配制5%，10%，20%的H2O2-水溶液和2.5，5，10 mg/mL的Na2SO3-水溶液，将色素溶液与H2O2-水溶液或Na2SO3-水溶液9 ∶1（V ∶V）混合，对照为色素溶液与水9∶1（V∶V）混合，避光放置24 h，在2，4，8，24 h 取样测量色素溶液的吸光值及色调，计算色素残留率与色差。

1.3.8 数据处理与分析 每个试验重复3 次，采用SPSS 17.0 软件分析数据，置信度为95%（P=0.05）

2 结果与分析

2.1 栀子红色素衍生物制备工艺条件优化

2.1.1 不同料液比对栀子红色素衍生物产量的影响 由图1可知栀子红色素衍生物的产量在料液比（水溶性栀子红色素∶乙酸酐）为1∶20（m∶V）时达到最高0.451 g。之后，随着料液比的增加栀子红色素衍生物的产量不再增加，说明此时水溶性栀子红色素与乙酸酐已基本反应完全，反应的最佳料液比是水溶性栀子红色素∶乙酸酐=1∶20 （m∶V）。

2.1.2 不同反应时间对栀子红色素衍生物产量的影响 由图2可知栀子红色素衍生物的产量在反应时间为4 h 时达到最高值0.453 g，之后随着反应时间的增加栀子红色素衍生物的产量不再增加，说明此时水溶性栀子红色素与乙酸酐已基本反应完全，反应的最佳反应时间是4 h。

2.1.3 不同反应温度对栀子红色素衍生物产量的影响 由图3可知栀子红色素衍生物的产量在反应温度为20～60 ℃时达到最高值0.456 g，之后随着反应温度的增加栀子红色素衍生物的产量降低，这可能是因为温度过高造成色素分解，水溶性栀子红色素与乙酸酐在常温下反应即可。

2.1.4 验证试验 由上述单因素试验获得最佳反应条件：料液比为水溶性栀子红色素∶乙酸酐=1∶20（m∶V），反应时间4 h，反应温度为室温。在此条件下做验证试验，获得栀子红色素衍生物0.455 g，色价为63.7，色调L*=71.01，a*=26.19，b*=-10.12。

2.2 栀子红色素衍生物的紫外-可见吸收光谱图

由图4可知栀子红色素衍生物的最大吸收波长为531 nm，水溶性栀子红色素的最大吸收波长为527 nm，肉眼所见红色及红紫色的紫外-可见吸收波长为490～550 nm，均为栀子红色素，而化学改性使栀子红色素衍生物的结构发生变化，最大吸收波长发生红移（向长波长方向移动）。以上述栀子红色素衍生物的最大吸收波长作为特征吸收峰进行后续研究。

图1 不同料液比对色素产量的影响Fig.1 Effect of different feed liquid ratio on the yield of pigment

图2 不同反应时间对色素产量的影响Fig.2 Effect of different reaction time on the yield of pigment

图3 不同反应温度对色素产量的影响Fig.3 Effect of different reaction temperature on the yield of pigment

图4 两种栀子红色素的紫外-可见吸收光谱图Fig.4 UV-Vis absorption spectrogram of two gardenia red pigments

2.3 醇溶性栀子红色素衍生物的溶解性

水溶性栀子红色素、醇溶性栀子红色素衍生物在不同溶剂中的溶解性见表1。化学改性后，醇溶性栀子红色素衍生物可溶于无水乙醇和水，其极性有所降低，扩大了溶解范围。

表1 两种栀子红色素在不同溶剂中的溶解性Table 1 Solubility of two gardenia red pigments in different solvents

2.4 醇溶性栀子红色素衍生物的稳定性

2.4.1 光照稳定性 醇溶性栀子红色素衍生物在阳光照射（40 000 lux）、灯光直射（13 000 lux）、室内散射（300 lux）和阴暗避光（对照）条件下的光照稳定性如图5和表2所示。图5表明，醇溶性栀子红色素衍生物在灯光直射和阳光照射条件下色素损失较多，6 d 后色素的残留率仅为29.88%和19.12%；而在室内散射和阴暗避光条件下，醇溶性栀子红色素衍生物较稳定，6 d 后色素残留率为89.86%和86.41%。表2结果与图5结果基本一致，4 种光照条件下亮度差（ΔL*）、红值差（Δa*）、蓝值差（Δb*）和总色差（ΔEab*）的变化程度由大到小为阳光照射、灯光直射、室内散射、阴暗避光。

2.4.2 热稳定性 醇溶性栀子红色素衍生物在室温（25 ℃，对照），40，60，80，100 ℃条件下的稳定性，如图6和表3所示。图6结果表明，温度越高醇溶性栀子红色素衍生物的残留率越低，然而在100 ℃下保温4 h 后色素的残留率仍有84.96%。由此表明醇溶性栀子红色素衍生物的温度稳定性较好。表3与图6结果基本一致，5 种温度条件下亮度差（ΔL*）、红值差（Δa*）、蓝值差（Δb*）和总色差（ΔEab*）的变化程度由大到小为100 ℃＞80 ℃＞60 ℃＞40 ℃＞25 ℃。

图5 栀子红色素衍生物的光照稳定性-色素残留率Fig.5 The light stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

图6 栀子红色素衍生物的温度稳定性-色素残留率Fig.6 The thermal stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

表2 栀子红色素衍生物的光照稳定性-色差Table 2 The light stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

表3 栀子红色素衍生物的温度稳定性-色差Table 3 The thermal stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

2.4.3 pH 稳定性 醇溶性栀子红色素衍生物在pH=3，4，5，7，9，11，13 条件下和色素原液pH=4.5（对照）的稳定性如图7和表4所示。图7结果表明，当色素溶液在pH=3～4.5 时醇溶性栀子红色素衍生物的稳定性较好，24 h 后色素残留率在97.49%以上，而在pH≥5 时醇溶性栀子红色素衍生物的溶液在6 h 时均出现不同程度的沉淀现象，说明醇溶性栀子红色素衍生物在酸性条件下较稳定，中性及碱性条件下易发生沉淀。表4结果与图7结果基本一致，在pH≥5 时醇溶性栀子红色素衍生物溶液发生沉淀，亮度差（ΔL*）、红值差（Δa*）、蓝值差（Δb*）和总色差（ΔEab*）与pH=3～4.5条件下相比变化巨大。

2.4.4 金属离子稳定性 醇溶性栀子红色素衍生物在多种金属离子存在的条件下稳定性如图8和表5所示。图8表明，醇溶性栀子红色素衍生物溶液中有Sn2+时稳定性最差，易发生沉淀，可能是由于Sn2+与醇溶性栀子红色素衍生物发生螯合作用而产生沉淀；在有Fe2+时稳定性较差，24 h 后色素残留率为72.82%；而其它金属离子对醇溶性栀子红色素衍生物溶液影响不大。表5结果与图8结果基本一致，Sn2+和Fe2+存在时醇溶性栀子红色素衍生物溶液24 h 后亮度差（ΔL*）、红值差（Δa*）、蓝值差（Δb*）和总色差（ΔEab*）较大，其它金属离子存在时色差小。

图7 栀子红色素衍生物的pH 稳定性-色素残留率Fig.7 The pH stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

图8 栀子红色素衍生物的金属离子稳定性-色素残留率Fig.8 The metals ion stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

表4 栀子红色素衍生物的pH 稳定性-色差Table 4 The pH stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

表5 栀子红色素衍生物的金属离子稳定性-色差Table 5 The metals ion stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

（续表5）

2.4.5 氧化还原稳定性 醇溶性栀子红色素衍生物在不同浓度氧化剂 （H2O2） 和还原剂（Na2SO3） 存在条件下的稳定性如图9和表6所示。图9表明，醇溶性栀子红色素衍生物溶液中有氧化剂（H2O2）存在时较稳定，24 h 后色素残留率在86.66%以上；而有还原剂（Na2SO3）时易发生沉淀，24 h 后色素残留率最高仅6.37%。表6结果与图9结果基本一致，在有氧化剂（H2O2）时，亮度差（ΔL*）、红值差（Δa*）、蓝值差（Δb*）和总色差（ΔEab*）较小，在有还原剂（Na2SO3）时色差较大。

图9 栀子红色素衍生物的氧化还原稳定性-色素残留率Fig.9 The redox stability of gardenia red pigment derivative-rate of residual pigment

表6 栀子红色素衍生物的氧化还原稳定性-色差Table 6 The redox stability of gardenia red pigment derivative-chromatism

3 讨论与结论

3.1 讨论

天然色素因色调自然、安全性高、有营养价值、有药理作用等优点而受到人们青睐，然而其存在溶解范围窄、稳定差、价格较贵等缺点，阻碍了天然色素在食品工业中的应用[14]。此外，在天然色素的发展中常伴有物理、化学或生物因素造成的变色、褪色等问题。为了改善天然色素的溶解性及稳定性，扩大色素的应用范围，通过添加护色剂、包埋、化学改性等方法对天然色素进行改良[15]。其中，在化学改性法方面，有研究学者采用甲基化法、金属离子络合法、酯化法等方法与色素已有官能团反应来改变色素性质，从而改变色素的溶解性并提高稳定性。如李晓辉[16]利用硫酸二甲酯对萝卜红色素进行化学改性，改性后色素的水溶解率为92%，相比于萝卜红色素提升了196%；李炎等[17]采用有机酸盐与辣椒红色素反应得到可溶于水的辣椒红色素锌络盐；Cruz 等[18]采用原花青素与硬脂酰氯发生酯化反应，纯化得到得率为70%的亲脂性酰基化原花青素；林燕[19]采用顺丁烯二酸酐和异丙醇对水溶性红曲色素进行化学改性获得脂溶性红曲色素；杨志等[20]采用乙酸酐与水溶性栀子蓝色素发生酯化反应，得到可溶于无水乙醇的憎水性栀子蓝色素；张芳等[21]研究了憎水性栀子蓝色素的稳定性，结果表明：色素的吸光值在酸溶液中略有下降而在碱溶液中反而上升；憎水性栀子蓝色素对还原剂稳定，而在氧化剂存在时褪色明显；Mg2+和Ca2+有一定护色作用，而Cu2+、Fe2+和Sn2+会使色素出现沉淀。本研究结果表明，利用酯化法获得的醇溶性栀子红色素衍生物可扩大其溶解范围。

3.2 结论

采用乙酸酐酯化法制备醇溶性栀子红色素衍生物，确定其特征吸收波长并考查其溶解性和稳定性。其制备最佳工艺条件为：料液比为水溶性栀子红色素∶乙酸酐=1 ∶20（m ∶V），反应时间4 h，反应温度为室温；醇溶性栀子红色素衍生物可溶于无水乙醇和水，扩大了溶解范围；在室内散射光、高温、酸性、氧化剂存在，无Sn2+和Fe2+离子存在的条件下稳定性较好。