干巴菌挥发性化学成分的HS-SPME-GC-MS分析*

叶肖辰皓，姜珊珊，叶 敏**

（1.烟台大学化学化工学院，山东 烟台 264005；2.云南农业大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201）

干巴菌（Thelephora ganbajun） 也叫对花菌、马牙菌，是伞菌纲（Agaricomycetes） 革菌目（Thelephorales） 革菌科（Thelephoraceae） 革菌属（Thelephora） 的1种风味独特的高等可食用真菌[1]。干巴菌对生态环境要求特殊、地域分布特征极为明显，仅分布在云南省的昆明、呈贡、嵩明、安宁、楚雄、易门、保山、曲靖、马龙等地海拔为1 000 m～2 200 m的弱酸性红土山林中，且该菌与松树有外生菌根关系，难以实现人工栽培[2-4]。干巴菌不仅具备独特、浓郁鲜香的风味，还富含氨基酸、蛋白质、黄酮、粗多糖、矿质元素、维生素等大量营养物质，具有很高的营养和保健价值，是1种极具云南特色的珍贵野生食用菌[5-6]。经广泛的文献检索发现国内外对干巴菌的研究十分有限，现有研究主要集中在分类、菌种分离、营养成分测定和生态学关系等方面，对其挥发性化学成分的分析研究相对较少。吕瑜平等[7]采用水蒸气蒸馏和乙醚萃取法提取干巴菌的挥发油，经气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 分离和鉴定了云南干巴菌中挥发成分。王茜茜等[7]分别采用静态顶空和顶空固相微萃取法，提取云南野生干巴菌的香气成分，利用气相色谱-质谱联用进行定性定量分析，对2种方法所得的香气成分进行了比较。

固相微萃取（solid-phase micro-extraction,SPME），适用于分析挥发性有机化合物。由于熔融石英纤维涂附的固定相不同，对各种不同待测物质的吸附和富集能力差异较大，使用固相微萃取技术进行挥发性化学成分分析，必须正确选择和使用不同类型的吸附纤维。

检索现有文献结果表明，采用不同种类的固相微萃取吸附纤维萃取干巴菌挥发性化学成分，并用气质联用进行分析的研究鲜有报道。采用Carboxen/PDMS、PDMS和DVB/CAR/PDMS三种不同特性的SPME吸附纤维，利用顶空（head space，HS） 萃取干巴菌的挥发性化学成分，并用气质联用仪进行分析，通过比较3种吸附纤维所吸附的挥发性物质种类和含量的差异，推测干巴菌的主要香气成分，为后续干巴菌的挥发性化学成分的系统研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试野生干巴菌采自昆明市富民县罗免乡山地松树林，样品采摘后立即带回实验室进行挥发性化学成分的SPME顶空收集。

1.2 实验仪器

气相色谱-质谱联用仪Agilent 7890A/5975N（美国Agilent公司）；HP-5MS石英毛细管柱，30.00 m×0.25 mm × 0.25 μm （美国 J&W Scientific 公司）；电子分析天平（AL-104型）、Mettler Toledo（仪器有限公司）；固相微萃取手动进样手柄（57330-Supelco）、美国（Supelco公司）；固相微萃取头，100 μm PDMS、 75 μm Carboxen/PDMS 和 50/30 μm DVB/CAR/PDMS（美国Supelco公司）；50 mL顶空萃取瓶（上海安谱科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

将洗净的50 mL顶空萃取瓶至于180℃下烘烤1 h，除去瓶中挥发性物质，冷却后将5 g干巴菌置于其中，25℃平衡60 min后分别使用3种SPME纤维（100 μm PDMS、75 μm Carboxen/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）吸附其挥发物。SPME纤维在使用前，于250℃、50 mL·min-1条件下氮吹老化30 min，然后将SPME纤维插入顶空萃取瓶吸附30 min后立即在GC-MS进样口230℃解吸附5 min，同时进行GC-MS数据采集。

1.3.1 气相色谱条件

柱箱初始温度40℃，保持2 min，以5℃·min-1升至250℃，保持6 min，总运行时间50 min；进样口温度为230℃；载气为高纯氦气（纯度99.999%），流量 1.0 mL·min-1，无分流进样。

1.3.2 质谱条件

电离方式为电子轰击（EI） 电离，电离能量70 eV；接口温度280℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，离子扫描范围m/z 50～550；溶剂延时4 min。

1.3.3 化合物定性与定量

经NIST 08质谱数据库检索定性，按相似度＞80%的原则作为鉴定结果，按峰面积归一化法计算化合物的相对百分含量。

2 试验结果分析

2.1 干巴菌挥发性化学成分的组成

用3种不同极性的SPME吸附纤维吸附干巴菌的挥发性化学成分，并用GC-MS进行分析鉴定。3种不同吸附纤维所得的GC-MS总离子流图如图1所示。

从图1可以看出，在检测到的干巴菌挥发性成分中硫醚类和烯烃类化合物在含量较高，是干巴菌的主要挥发性化学成分。在分离鉴定的24种挥发性化学成分中，含有烯烃类化合物8种、醇类化合物4种、苯2种、酮、肟、硫醚类化合物各1种，另有其他化合物7种，详见表1。

图1 不同SPME吸附纤维萃取干巴菌挥发性化学成分的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds of Thelephora ganbajun extracted by different SPME fiber coating

由表1可知，不同的SPME吸附纤维对干巴菌挥发性成分吸附的种类有较大差异。DVB/CAR/PDMS共检测到21种挥发性成分，Carboxen/PDMS共检测到11种挥发性成分，而PDMS仅检测到有3种挥发性成分，PDMS是3种SPME吸附纤维中吸附挥发性化学成分最少的1种吸附纤维。有少数的化合物能被3种SPME纤维吸附，而大多数化合物则只能被1种或2种纤维吸附。Carboxen/PDMS和DVB/CAR/PDMS共同检测到的组分有二甲基二硫醚（Dimethyl disulfide）、二甲基硅氧烷环三聚物（Dimethylsiloxane cyclic trimer）、1R-α-蒎烯（1R-α-Pinene）、莰烯 （Camphene）、 (-)-α-蒎烯（(-)-α-Pinene）、八甲基环四硅氧烷 （Oktamethylcyklotetrasiloxan）、桉叶油醇（Eucalyptol）、1-十一烯（1-Undecene）、 (-)-樟脑（(-)Camphor） 和十甲基环戊硅 氧 烷 （Decamethylcyclopentasiloxane）。 PDMS、Carboxen/PDMS和DVB/CAR/PDMS三种吸附纤维共同检测到的组分仅有1-十一烯（1-Undecene）。

表1 3种不同吸附纤维萃取的干巴菌挥发性化学成分及其相对含量Tab.1 The volatile compounds and their relative contents of Thelephora ganbajun extracted by three different SPME fiber coatings

2.2 不同SPME吸附纤维吸附挥发性成分能力的差异

PDMS、Carboxen/PDMS和DVB/CAR/PDMS 3种吸附纤维吸附化合物的总峰面积如图2所示。

图2 3种不同SPME纤维吸附干巴菌挥发性成分的总峰面积Fig.2 Total peak areas of volatile compounds of Thelephora ganbajun extracted by different SPME fiber coating

图2研究结果表明，不同的SPME吸附纤维对挥发性化学成分的吸附能力不同，其中Carboxen/PDMS的吸附能力最强；DVB/CAR/PDMS次之，Carboxen/PDMS吸附的总峰面积为 76.17%；而PDMS吸附能力最弱，吸附的总峰面积仅为Carboxen/PDMS的3.89%。3种不同SPME吸附纤维对干巴菌中不同挥发性化学成分的吸附能力差异很大，具体试验结果如图3所示。

从图3可以看出，各吸附纤维对不同挥发性化学成分的吸附能力差异很大，Carboxen/PDMS对二甲基二硫醚表现出特异的高吸附能力；DVB/CAR/PDMS对二甲基二硫醚也表现出较高的吸附能力，而PDMS则对二甲基二硫醚无响应；3种纤维对1-十一烯均能吸附，但DVB/CAR/PDMS的吸附能力最强，Carboxen/PDMS次之，PDMS的吸附能力最弱。

图3 3种不同吸附纤维萃取的干巴菌挥发性化学成分峰面积比较Fig.3 Comparison of volatile compounds from Thelephora ganbajun extracted by three different fiber coating

3 讨论

云南因其特殊的地理环境和独特的气候条件，非常适合野生食用菌的生长。云南的野生食用菌种类占中国野生食用菌种类的67%以上，占全世界野生食用菌种类的50%[1]。在云南众多的野生食用菌中，干巴菌是一种风味独特的珍稀野生食用菌，因其香味浓郁、滋嫩香甜、肉质坚韧，且有一种酷似腌牛肉干的浓郁香味，而得名干巴菌，广受人们喜爱。干巴菌除风味独特外还富含抗氧化物质，Xu D.P等[8]采用超声波辅助提取法提取干巴菌中的抗氧化物质，研究了提取物对人体癌细胞的抗增生作用。研究结果表明，干巴菌的提取物对人体肺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞 （MCF-7）、肝癌细胞（HepG2）和结肠癌细胞（HT-29） 均有抗增生作用，其中以对肝癌细胞和肺癌细胞的抗增生作用尤为显著，干巴菌提取物中的芸香甙（rutin）、2-苯丙酸（2-hydrocinnamic acid） 和表儿茶酸 （epicatechin），可能是抗氧化和抗增生作用的主要活性化合物。

固相微萃取（SPME）是一种新兴的无溶剂特殊萃取方法，适用于各种挥发性有机化合物的萃取，被广泛地应用于花卉、蘑菇、葡萄酒等的香气成分萃取和分析，关于其应用已有很多文献报道[9-12]。本研究中采用 Carboxen/PDMS、PDMS和 DVB/CAR/PDMS 3种不同特性的SPME吸附纤维，结合GCMS联用技术从干巴菌中的共检测到24种挥发性化学成分，这些挥发性化学成分主要为硫醚类和烯烃类化合物，相对含量大于5%的化合物有二甲基二硫醚、1R-α-蒎烯和1-十一烯，根据相对含量的占比来分析可以判断野生干巴菌的特征香气成分为二甲基二硫醚、1R-α-蒎和烯1-十一烯。Majid[9]研究表明HS-SPME法检测到的云南野生干巴菌的挥发性成分有主要是醛类、酮类和弱极性的烃类化合物，本研究中也发现野生干巴菌中烃类化合物含量较高，但酮类化合物含量较低，没有检测到醛类化合物，这可能与野生干巴菌的生长环境、生长阶段和所使用的SPME吸附纤维种类不同等因素有关。不同极性的SPME吸附纤维吸附挥发性成分差异明显， Carboxen/PDMS检测到11种挥发性成分，且对二甲基二硫醚具有特异的高吸附能力；在采用的3种SPME吸附纤维中，DVB/CAR/PDMS检测到的挥发性成分最多，检测到6种烯烃类化合物、3种醇类化合物、2种苯、1种硫醚类化合物、1种酮类化合物、1种肟类化合物和7种其他化合物，可能是因为DVB/CAR/PDMS由碳分子筛和聚二甲基硅氧烷复合材料制成，该吸附纤维有较多微孔，能够吸附痕量挥发性成分[13]，但其对二甲基二硫醚的吸附能力不如Carboxen/PDMS；PDMS仅检测到3种挥发性成分，是试验选用的3种吸附纤维中检测到挥发性成分最少的1种，证明PDMS不适用于干巴菌挥发性化学成分的萃取和分析。干巴菌挥发性化学成分的相对含量比较分析结果表明，干巴菌的主要挥发性化学成分是二甲基二硫醚、1R-α-蒎烯和1-十一烯，这三种化合物均具有特殊的香气，可以推测这三种物质是影响干巴菌风味的关键挥发性化学成分。