β-榄香烯与姬松茸萃取物的抗肿瘤作用和药理学研究*

薛天乐，王 庆，孙守国，刘耀武**

（1.安徽省中医药科学院亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800；2.安徽九洲方圆制药有限公司，安徽 亳州236800）

伴随着现代药理学研究的不断深入，越来越多具有抗肿瘤作用的有效成分开始被应用于临床肿瘤治疗中[1-2]。β-榄香烯是一种分离自莪术中的有效成分，这种成分的动物试验证实，其对某些恶性肿瘤具有一定的抗肿瘤作用[3-5]。而食用菌中的功能性生物活性成分使得其逐渐成为药理学研究的热点[6]。为了验证β-榄香烯与食用菌萃取物的作用，本研究以动物试验形式进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

取60只纯系小鼠作为研究对象，随机分为肝癌对照组（n=15）、肝癌用药组（n=15）、艾氏腹水癌对照组（n=15）、艾氏腹水癌（n=15） 共4个组别。4组小鼠均包含雌鼠、雄鼠，体重19 g～23 g，性别及体重差异均不显著。

1.1.2 药物

β-榄香烯：取莪术（产地：浙江温州瑞安县）根茎挥发油，提取β-榄香烯成分。助溶剂选用5%浓度吐温-80。食用菌萃取物：将姬松茸（福州华盛食品有限公司）经粉碎、预处理、热水浸提以及滤渣复提等流程，制备萃取物。

1.2 方法

1.2.1 抗肿瘤试验

严格按照抗癌药物会议制定标准，针对各组纯系小鼠开展抗肿瘤试验。其中，肝癌对照组小鼠的处理方法为，于合并肝癌条件下，按照0.2 g·kg-1剂量给予肝癌对照组小鼠试剂吐温-80，经腹腔给药8次；肝癌用药组小鼠的处理方法：于合并肝癌条件下，按50 mg·kg-1剂量，经腹腔连续给予纯系小鼠注射适量β-榄香烯，并按照10 mg·kg-1剂量，给予肝癌用药组纯系小鼠连续注射8次姬松茸萃取物。艾氏腹水癌对照组小鼠的处理方法为，按照0.2 g·kg-1剂量，经腹腔给予纯系小鼠注射适量吐温-80，注射次数为7次。艾氏腹水癌用药组小鼠的处理方法：按照50 mg·kg-1剂量，经腹腔给予纯系小鼠注射适量β-榄香烯，注射次数为连续注射7次；同时按照10 mg·kg-1剂量，给予艾氏腹水癌纯系小鼠注射适量姬松茸萃取物。

1.2.2 免疫试验

经小鼠延缓型超敏反应评估β-榄香烯与食用菌萃取物对小鼠免疫机制的影响。试验流程为经各组纯系小鼠左侧脚垫皮下注入浓度2%，即2×108个/mL的绵羊红细胞，等待4 d后，再次经小鼠右侧脚垫相同位置注入等剂量绵羊红细胞。分别于攻击前后，精确测定各组小鼠右侧脚垫的厚度变化状况。

1.2.3 癌细胞分离指数试验

取第7天艾氏腹水癌纯系小鼠，按照50 mg·kg-1剂量经腹腔注射β-榄香烯，以10 mg·kg-1剂量经腹腔注入姬松茸萃取物，分别于用药后0和8 h，取冰乙酸-甲醇（混合比例为1∶3） 固定标本，固定处理结束后，以Giemsa染色法染色。将小鼠标本置于40×10倍显微镜下，观察其癌细胞分裂指数（计算标准：计数1 000个癌细胞中的分裂细胞数）。

1.2.4 肝癌细胞影响试验

取人体肝癌标本培养的03上皮细胞肝癌株以1640培养液进行传代培养，培养方法为：向培养液中混入20%浓度的小牛血清。最终获得15万/mL肝癌细胞。分别向培养液中混入吐温-80、β-榄香烯与姬松茸萃取物。混合后按照每日1次的频率，定期取样，观察培养液中的肝癌细胞形态是否出现改变，并统计肝癌细胞的台盼兰着色状况。

1.2.5 癌细胞核酸测定

给予纯系小鼠接种艾氏腹水癌细胞后第5天，经腹腔给予纯系小鼠注入50 mg·kg-1β-榄香烯、10 mg·kg-1姬松茸萃取物，连续注射3次（每日1次），于第7天抽吸纯系小鼠腹水，经腹水标本测定癌细胞RNA、DNA含量水平。

1.3 观察指标

分析β-榄香烯与食用菌萃取物的抗肿瘤作用；评估β-榄香烯与食用菌萃取物对小鼠免疫反应的影响；判断β-榄香烯与食用菌萃取物对癌细胞分离指数的影响；评价β-榄香烯与食用菌萃取物对肝癌细胞的杀伤作用；统计β-榄香烯与食用菌萃取物对癌细胞RNA合成及DNA合成的影响。

1.4 统计学方法

以 SPSS 17.0 软件统计。P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 抗肿瘤作用

抗肿瘤作用见表1。

由表1可知，肝癌对照组生命延长率6.67%，低于肝癌用药组（P＜0.05）；艾氏腹水癌对照组生命延长率 13.33%，低于艾氏腹水癌用药组 （P＜0.05）。

2.2 对小鼠免疫反应的影响

对小鼠免疫反应的影响见表2。

表1 抗肿瘤作用Tab.1 Anti-tamor effect

表2 对小鼠免疫反应的影响Tab.2 Effect on immune response in mice

由表2可知，吐温-80对照组24 h脚垫增加厚度 （7.26±3.13） mm、48 h 增加厚度 （3.96 ± 1.24）mm，均高于β-榄香烯与姬松茸萃取物联合用药组（P＜0.05）。

2.3 对癌细胞分离指数的影响

对癌细胞分离指数的影响见表3。

表3 对癌细胞分离指数的影响Tab.3 Effect on cancer cell separation index

由表3可知，吐温-80对照组用药后立即癌细胞分裂指数 （37.1 ± 5.2）‰、用药后 8 h（34.2 ±4.2）‰，均高于β-榄香烯与姬松茸萃取物联合用药组，差异不显著。

2.4 对肝癌细胞的杀伤作用

采取体外培养法培养肝癌细胞。吐温-80对比试验结果显示，24 h时，肝癌细胞形态无明显改变，台盼兰着色率水平为9.5%；48 h时，少部分肝癌细胞外部形态改变，台盼兰着色率水平升高至18.9%。而向肝癌细胞培养液中混入 1 mg·mL-1～2 mg·mL-1β-榄香烯及0.5 mg·mL-1姬松茸萃取物，持续作用24 h时的影响作用显示：肝癌细胞核伴明显固缩，癌细胞边缘不规则，台盼兰着色率水平为46.2%；持续作用48 h时，β-榄香烯与姬松茸萃取物的杀伤作用显示，大部分肝癌细胞的外部形态改变，且伴有细胞碎裂，台盼兰着色率水平为65.9%。

2.5 对癌细胞RNA合成及DNA合成的影响

对癌细胞RNA合成及DNA合成的影响见表4。

表4 对癌细胞RNA合成及DNA合成的影响Tab.4 Effect on RNA synthesis and DNA synthesis of cancer cells

由表4可知，吐温-80对照组RNA压积细胞含量 （590.32 ± 142.81） μg·50-1μL-1、DNA 含量（228.34±40.61） μg·50-1μL-1，均高于 β-榄香烯与姬松茸萃取物联合用药组 （P＜0.05）。

3 讨论

近年来，肝癌、腹水癌等恶性肿瘤的发病率持续升高[7]。伴随着恶性肿瘤患者规模的不断扩大，人们对恶性肿瘤治疗的关注度逐渐升高[8]。从目前恶性肿瘤的治疗体系来看，其治疗方法以手术治疗、药物治疗为主[9]。其中，手术治疗虽然具备一定的价值，但其适用范围有限，且部分恶性肿瘤患者经手术治疗后，还会面临术后复发的问题[9-10]；而在药物治疗方面，可用于恶性肿瘤治疗的药物类型较多，但其效果整体欠佳。事实上，恶性肿瘤患者及家属更倾向于选择一种更加安全、有效、无创的治疗方案[11-12]。在这一背景下，越来越多的新型抗肿瘤药物或具备抗肿瘤作用的成分，开始被应用于临床肿瘤干预中。

β-榄香烯是一种分离自莪术的二类非细胞毒性抗肿瘤药物。相对于其他抗肿瘤药物而言，这种来源于温郁金的抗肿瘤药物具有明显的高效性、广谱抗肿瘤及低毒性等优势[13]。β-榄香烯的抗肿瘤作用早有文献报道，但这种药物的抗肿瘤作用机制、药理学特征尚未完全明确[14]。

食用菌萃取物也是一种被明确证实具有抗肿瘤作用的成分[15]。事实上，多种食用菌萃取物均具有一定的抗肿瘤作用。其中，姬松茸的动物实验结果显示，这种食用菌中的有效成分同时具备杀菌、抗肿瘤、抗突变以及增强免疫力等多种作用[16]。

从理论角度来讲，将β-榄香烯与食用菌萃取物联用，可发挥出更加显著的抗肿瘤作用。为了验证二者联用的价值，本研究中主要采取动物试验形式，评估联合用药的抗肿瘤作用，结果提示，肝癌用药组生命延长率80.00%、艾氏腹水癌用药组生命延长率 93.33%，均高于对照组 （P＜0.05），表明 β-榄香烯与姬松茸萃取物可对肝癌、艾氏腹水癌产生一定的抗肿瘤作用。

综上所述，β-榄香烯与姬松茸萃取物的抗肿瘤作用主要与对癌细胞RNA、DNA合成的抑制机制有关。