盐胁迫对小麦根系氧化损伤及细胞程序性死亡的影响

李有芳，王石平，丁金金，李卫华

(石河子大学农学院/新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子 832000)

小麦是重要的粮食作物，对我国农业和经济发展具有重要的价值[1]。近年来，随着土壤盐渍化的加重，农作物产量和品质不断下降。根系作为植物吸收水分和养分的主要器官，其正常的生理代谢直接影响作物的生长发育、产量和品质[2]。盐胁迫下植物根系最先感知逆境胁迫信号并做出相应的生理代谢反应[3]。因此，探究盐胁迫下，植物根系的生理变化对开展小麦耐盐育种和栽培具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选用耐盐性不同的小麦(TriticumaestivumL.)品种新春11号(高耐盐)、新春29号(中耐盐)、新春6号(盐敏感)为供试材料，由石河子大学麦类作物研究所提供。

1.2 根尖培养与盐处理

选取大小一致，籽粒饱满的小麦种子100粒，用1‰氯化汞消毒5 min后，用去离子水清洗3次，均匀排布在发芽盒中，放置于25 ℃的光照培养箱中进行培养。当根系长度达到3～4 mm时，用300 mmol·L-1的NaCl对供试小麦进行胁迫处理，以蒸馏水作对照(CK)，每个处理3次重复，处理液每天更换1次，处理7 d后结束。

1.3 根长与干、鲜重的测定

在NaCl处理后第3、第5、第7天取样，每个处理取10株小麦幼苗测定其根长与干、鲜重，重复3次，具体参考弋良朋等[14]的方法。

1.4 根尖细胞活性氧及抗氧化酶活性的测定

1.5 根尖伊文思蓝(Evans Blue)染色

取NaCl处理0、4、8和12 h后的根尖，染色具体参照Young等[18]方法。将样品置于0.1%的Evans Blue的水溶液中浸染2 min，取出根尖，纯净水清洗表面蓝色染液，光学显微镜下观察染色情况。

1.6 DNA提取和电泳检测

用植物基因组DNA提取试剂盒EasyPure Plant Genomic DNA Kit提取NaCl处理0、4、8和12 h后的根尖细胞DNA，核酸蛋白分析仪(NanoDrop，USA)检测基因组DNA的纯度和浓度。3.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA片段化检测，硝酸银染色观察。

1.7 数据分析

用Excel 2010和SPSS 13.0处理数据。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对小麦根长及根系生物量的影响

正常生长条件下随着生长发育的不断推进，小麦的根长逐渐增长，三品种间无明显差别。盐胁迫大大减缓了小麦根系伸长生长。由图1A可见，盐胁迫处理后各时期小麦的根长显著低于对照。盐胁迫对根长的影响在品种间存在显著差异。盐处理7 d后，新春29号的根长显著高于新春6号和新春11号。盐处理后，小麦根系鲜重和干重与对照相比显著下降(图1B)。在处理7 d后，新春11号和新春29号根鲜重显著大于新春6号。随着胁迫时间的延长，根系干重逐渐增加(图1C)。三个品种中，盐处理和对照间根系干重存在明显差异。盐处理3 d和5 d后，新春6号根系干重与新春11号和新春29号差异显著，而盐处理7 d后三品种间无显著差异。这些结果表明，盐处理后期耐盐品种新春11号、新春29号的根系继续生长，相比新春6号受到盐胁迫的影响较小。

2.2 盐胁迫对小麦根尖活性氧含量的影响

2.3 盐胁迫对小麦根尖抗氧化酶活性的影响

盐胁迫后各小麦品种的根尖SOD活性呈单峰曲线变化，在盐处理后30 min左右达到最高水平，而对照变化平稳(图3A)。胁迫开始后盐处理相比对照均显著上升，盐胁迫120 min后与对照相近。小麦SOD最大活性以新春29号最高，新春6号最低，三个品种间差异均显著。在受到盐胁迫后，三个品种APX活性均迅速上升，也在30 min左右达到最大值，随后开始不断下降，最终均降至低于对照组。盐处理后新春6号APX活性快速升高，显著高于新春29号和新春11号(图3B)。这些结果说明，在受到盐胁迫后，小麦根系抗氧化酶的活性最初会有所上调，达到一定水平后开始下调，但不同酶活性下调的幅度不同。

图柱上不同字母代表处理间差异显著(P<0.05)。XC6：新春6号；XC11：新春11号；XC29：新春29号。图2、图3同。

Different letters above columns mean significant differences among the treatments at 0.05 level.XC6：Xinchun 6;XC11:Xinchun 11;XC29:Xinchun 29.The same in figures 2 and 3.

图1 盐胁迫对小麦根长及根系干重和鲜重的影响

Fig.1 Effect of salt stress on length，dry weight and fresh weight of wheat root

图2 盐胁迫对小麦根尖活性氧含量的影响

图3 盐胁迫对小麦根尖抗氧化酶活性的影响

2.4 盐胁迫对小麦根尖细胞活性的影响

Evans Blue染色结果发现,对照条件下除细胞间隙有未洗干净的染液外，小麦根尖细胞未被染色，形态结构良好；而盐处理的根尖部分细胞被染成蓝色，随着盐胁迫时间的延长，被染色细胞数目逐步增多(图4)。盐处理4 h后已经发生细胞程序性死亡；盐处理8 h后，根尖中相当一部分细胞被染成蓝色，细胞皱缩，细胞间隙增大；盐处理12 h后，整个根尖蓝色程度明显加深。盐胁迫12 h后，新春6号根尖被染色的细胞较多，新春29号次之，新春11号根尖染色细胞最少，说明在盐胁迫下，根尖细胞发生程序性死亡，而新春11号的细胞活性强于新春29号和新春6号，表现出较好的耐盐性。

2.5 盐胁迫对根尖细胞DNA降解的影响

经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，盐胁迫后小麦根尖DNA出现断带现象(图5)。不同耐盐品种的DNA断裂情况存在差异。盐敏感品种新春6号和中等耐盐品种新春29号在盐处理4 h左右发生DNA片段化，耐盐品种新春11号在盐胁迫8 h发生DNA片段化。对于同一品种，随着盐胁迫时间的延长，DNA断裂程度加重。

3 讨 论

根系的总根长和鲜、干重能够反映植物根系生长发育的好坏。翁亚伟等研究表明，盐胁迫下小麦的总根长及干物质重均显著下降[19]。本研究中耐盐性不同的三个小麦品种，在受到盐胁迫后，根长和鲜、干重均显著下降，和对照相比根系生长受到抑制，生长速度减慢。耐盐品种新春11号受到盐胁迫的抑制作用小于盐敏感品种新春6号。

A1～D1分别为新春6号CK、NaCl处理4 h、8 h、12 h；A2～D2分别为新春29号CK、NaCl处理4 h、8 h、12 h；A3～D3分别为新春11号CK、NaCl处理4 h、8 h、12 h。

A1-D1:Root tips of Xinchun 6 under CK and 4 h,8 h and 12 h after NaCl treatment；A2-D2:Root tips of Xinchun 29 under CK and 4 h,8 h and 12 h after NaCl treatment；A3-D3:Root tips of Xinchun 11 under CK and 4 h,8 h and 12 h after NaCl treatment.

图4 盐胁迫诱导小麦根尖细胞程序性死亡的光学显微镜观察

Fig.4 Light microscopic observation of programmed cell death induced by salt stress in wheat root tip cells

M：DNA标准分子量3000，1：新春6号对照，2：新春6号盐处理4 h，3：新春6号盐处理8 h，4：新春6号盐处理12 h；5：新春29号盐处理12 h，6：新春29号盐处理8 h，7：新春29号盐处理 4 h，8：新春29号对照，9：新春11号对照 10：新春11号盐处理 4 h，11：新春11号盐处理8 h，12：新春11号盐处理12 h。

M:DNA marker 3000,1:Xinchun 6 CK,2:Xinchun 6 under NaCl treatment for 4 h,3:Xinchun 6 under NaCl treatment for 8 h,4:Xinchun 6 under NaCl treatment for 12 h,5:Xinchun 29 under NaCl treatment for 12 h,6:Xinchun 29 under NaCl treatment for 8 h,7:Xinchun 29 under NaCl treatment for 4 h,8:Xinchun 29 under CK,10:Xinchun 11 under NaCl treatment for 4 h,11:Xinchun 11 under NaCl treatment for 8 h,12:Xinchun 11 under NaCl treatment for 12 h.

图5 小麦根尖基因组DNA片段化检测

Fig.5 Detection of wheat root tip genomic DNA fragmentation

细胞程序性死亡是一个完全由自身基因调控的过程，随着人们对植物程序性死亡研究的深入，发现PCD现象在植物中广泛存在[25]。Katsuhara[26]发现，高盐胁迫下大麦根尖分生组织发生细胞程序性死亡，可观察到典型的PCD形态和生化特征。宁顺斌等[27]对盐胁迫下玉米、水稻和烟草等植物根尖分生组织细胞形态和生化变化进行研究，发现根尖细胞原生质体皱褶、形态不规则、核物质浓缩、DNA片段化等现象。本试验中通过伊文思蓝染色，随着胁迫时间延长，染色加深，根尖细胞开始死亡；聚丙烯酰胺凝胶电泳结果则直观地表现了盐胁迫后小麦根尖PCD的发生。

本研究结果表明，盐胁迫诱导小麦根尖活性氧含量积累，抗氧化酶活性增强。随着盐胁迫时间的延长，抗氧化酶活性开始降低，直到与对照相近，造成活性氧的积累，促使小麦根尖发生细胞程序性死亡，且耐盐性小麦比敏感型小麦启动细胞程序性死亡要晚一些。