转cry1Ab/cry2Aj基因玉米双抗12-5对意大利蜜蜂成虫的影响

姜媛媛，纪 艺，来勇敏，祝 旋，陈笑芸，徐俊锋，马莲菊，徐晓丽，*

(1.沈阳师范大学 生命科学学院，辽宁 沈阳 110034； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所 省部共建农产品质量安全国家重点实验室，浙江 杭州 310021)

转基因植物的一个重要性状是抗虫性，通常通过在转基因植物中表达来自苏云金杆菌(Bacillusthuringensis，Bt)的杀虫晶体蛋白从而保护植物免受害虫的危害，其靶标害虫主要为鳞翅目和鞘翅目昆虫[1]。我国是最早种植转基因抗虫农作物的国家之一，主要为转基因抗虫棉花。近年来，我国在其他转基因抗虫农作物的研发方面也取得了很大的进展，获得了多个对鳞翅目昆虫具有较高抗性的转基因抗虫水稻和玉米新品系[2-3]。转基因植物获得批准进行商业化种植前一定要进行环境安全评价，其中一个重要的方面是评价其对非靶标生物的影响。根据我国《转基因生物安全评价指南》的要求，转基因抗虫植物需要提供对至少6种非靶标生物的安全评价结果。

蜜蜂是具有重要生态和经济意义的传粉昆虫，主要采集植物的花粉、花蜜或脂类物质作为食物，意大利蜜蜂和中华蜜蜂是两种重要的蜜蜂种类，可以为多种农作物授粉。花粉也是蜜蜂食物中唯一的蛋白来源，一个成年工蜂每日需摄入3.4～4.3 mg花粉[4]。通过取食花粉，蜜蜂有可能暴露于转基因植物表达的外源杀虫蛋白。因此，在转基因抗虫植物环境安全评价过程中，蜜蜂通常是最重要的指示生物[5-6]。通过在饲料中添加高于田间暴露水平、具有杀虫活性的纯蛋白或花粉，观察蜜蜂的生长发育参数从而评价该抗虫植物对其潜在的影响。大量对蜜蜂成虫或幼虫影响检测的研究显示：Bt抗虫作物或Cry蛋白对蜜蜂的生长发育无显著影响[7-15]。比如Hendriksma等[8]对表达Cry1A.105、Cry2Ab2和Cry3Bb1杀虫蛋白的转基因玉米MON 89034×MON 88017的研究显示，取食转基因玉米花粉对蜜蜂的生命表参数无显著影响；Niu等[11]对转基因抗虫棉的研究显示，表达Cry1Ac和Cry2Ab的抗虫棉花对蜜蜂成虫风险较低；Wang等[13]研究显示，取食表达Cry2A或Cry1C的转基因水稻花粉或纯蛋白对蜜蜂成虫的存活率和王浆腺发育没有显著不利影响。

转cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps基因抗虫耐除草剂玉米双抗12-5是由浙江大学研发的转基因玉米新品系，目前已获得批准进入生产性试验阶段。室内和田间试验显示，其对玉米螟、黏虫、棉铃虫等靶标害虫具有较高的抗性[16-17]。根据转基因植物安全评价个案分析的原则，每一个转基因植物新品系均需提供对非靶标生物的安全评价结果。在本研究中，首先通过对蜜蜂成虫饲喂转基因玉米双抗12-5花粉的方式评价其对意大利蜜蜂成虫可能产生的影响，之后又采用将蜜蜂成虫直接暴露于高于花粉中Cry1Ab表达水平10倍的蛋白浓度，从而增加了检测到不利影响的可能性。

1 材料与方法

1.1 试验昆虫和蛋白

试验蜂群来自浙江省义乌市福堂镇王焕兴蜂场。选用新出房意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)成年工蜂，试验前饥饿处理2 h。供试Cry1Ab蛋白购买于Envirologix公司，并保存于-80 ℃备用。

1.2 试验花粉

将转基因玉米双抗12-5及其非转基因对照玉米种植于浙江省农业科学院海宁市转基因植物试验基地，转基因玉米和非转基因对照各种植3个小区，每小区150 m2。在玉米盛花期收集花粉，室温下脱水24 h后，过200目筛并收集分装到50 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 花粉试验

将蜜蜂放置在正方体铁架蜂笼中，每笼10头，外围网纱。将蜂笼放置于没有光照的气候室，温度为(30±0.5)℃，相对湿度(70±1)%。试验的饲料为添加不同浓度花粉的50%蔗糖溶液。滴管去管留头，将食物添加进头部后倒立放置于蜂笼网纱小孔处，便于蜜蜂取食。花粉试验中，花粉处理为：1)非转基因对照玉米(瑞丰宝1号)花粉；2)转基因玉米(双抗12-5)花粉；3)蔗糖溶液；4)非转基因对照玉米花粉与300 mg·L-1的吡虫啉混合作为阳性对照。每笼10头意大利蜜蜂，每个处理4笼，即4个重复，每天检查意大利蜜蜂死亡情况并且更换饲料以保证蜜蜂每天暴露于新鲜花粉。饲喂14 d结束试验。试验过程中，第7和14天每处理取蜂2只，保存于-20 ℃冰箱，预备进行ELISA试验检测蜜蜂体内蛋白含量。

1.4 Cry1Ab蛋白试验

以50%蔗糖溶液饲喂蜜蜂，并在蔗糖溶液中添加Cry1Ab蛋白、牛血清蛋白(BSA)或吡虫啉，各处理分别为：1)含有8 μg·mL-1BSA的蔗糖溶液(阴性对照)；2)含有8 μg·mL-1Cry1Ab的蔗糖溶液；3)蔗糖溶液(空白对照)；4)含有300 mg·L-1吡虫啉蔗糖溶液(阳性对照)。在该实验中，Cry1Ab蛋白暴露浓度比转基因玉米双抗12-5花粉试验中高10倍以上。每笼10头意大利蜜蜂，每个处理4笼。每天观察死亡情况并更换蔗糖溶液。试验第7和14天每处理取蜂2只，保存于-20 ℃冰箱，预备进行ELISA试验检测蜜蜂体内蛋白含量。

1.5 取食量检测

每日称取各处理配置好的饲料并称取质量M1，次日更换饲料前收集前一天剩余饲料并称取质量M2，日取食量M=M1-M2，日平均取食量=M/活虫数。

1.6 ELISA检测

分别在花粉试验和Cry1Ab蛋白试验喂食第7和14天时各处理取2只蜜蜂用于ELISA检测。采用美国ENVIROLOGIX公司Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒检测。检测前将蜜蜂用试剂盒中的洗涤液进行冲洗，除去蜜蜂体表粘附的花粉或蛋白。将组织匀浆后，参照试剂盒说明书进行检测。采用酶标仪(美国伯乐680酶标仪)读板，测定450 nm处吸光值，记录数据。

1.7 数据分析

采用Excel对数据进行初步整理，并绘制蜜蜂的生存率曲线。采用SPSS 20.0进行差异性分析，取食量进行方差分析，若P<0.05，用Tukey’s HSD测验进行多重比较。采用单因素方差分析比较蜜蜂体内蛋白含量，并通过Excel绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 花粉试验

2.1.1 意大利蜜蜂的存活情况

饲喂蔗糖、转基因玉米双抗12-5花粉和非转基因对照玉米花粉14 d后，各处理组仍有90%的蜜蜂存活(图1)。饲喂300 mg·L-1吡虫啉，所有蜜蜂4 d内全部死亡。饲喂转基因玉米双抗12-5花粉与非转基因对照玉米花粉相比，意大利蜜蜂存活率没有显著差异(χ2检验；χ2=0，df=1，P=1.00>0.05)，饲喂吡虫啉的存活率显著低于普通花粉(χ2检验；χ2=83.077，df=3，P=0.000<0.05)。

2.1.2 意大利蜜蜂的取食情况

蜜蜂的取食量能直接反映蜜蜂的活性及整个蜂群的情况。饲喂蔗糖溶液、转基因玉米双抗12-5花粉和其非转基因对照玉米花粉14 d后，取食量没有显著差异(ANOVA; df=2，P=0.366>0.05)。饲喂300 mg·L-1吡虫啉，蜜蜂第2天出现拒食现象，取食量很少，显著低于其他处理组(ANOVA;df=3，P=0.00<0.05)(表1)。由于蜜蜂长时间生活在蜂笼，运动少、耗能低，因此后期取食量低于前期。

2.1.3 蜜蜂对Cry1Ab的摄取量

ELISA检测结果显示，饲喂非转基因对照玉米花粉和蔗糖溶液的蜜蜂体内并没有检测到Cry1Ab蛋白。饲喂转基因玉米双抗12-5花粉第7和14天时，蜜蜂体内蛋白含量分别为0.747和0.735 μg·g-1(图2)。

2.2 Cry1Ab蛋白试验

数据基于每次处理3次重复，每次重复10只个体蜜蜂。使用卡方检验比较存活率。Data was based on three replicates per treatment with 10 individual bees per replicate. Survival was compared using a Chi-Square test.图1 不同花粉饲喂处理下意大利蜜蜂的生存分析Fig.1 Effect of different pollen feeding treatments on survival of Apis mellifera worker adults

表1 不同花粉饲喂处理对意大利蜜蜂日取食量的影响

Table1Effect of different pollen feeding treatments on daily consumptions ofApismellifera

时间Time/d蜜蜂日平均取食量Daily consumptions of Apis mellifera/g非转基因玉米花粉Non-GM蔗糖Sucrose转基因玉米花粉GM300 mg·L-1吡虫啉Imidacloprid10.091±0.004 a0.107±0.009 a0.094±0.008 a0.011±0.003 b20.096±0.005 a0.107±0.013 a0.098±0.009 a0.005±0.002 b30.065±0.005 a0.076±0.002 a0.055±0.010 a0±0 b40.077±0.011 a0.078±0.003 a0.066±0.002 a0±0 b50.075±0.006 a0.071±0.006 a0.058±0.003 a0±0 b60.100±0.005 a0.113±0.001 a0.089±0.004 a0±0 b70.063±0.005 a0.067±0.006 a0.063±0.007 a0±0 b80.072±0.025 a0.084±0.004 a0.066±0.019 a0±0 b90.047±0.020 a0.051±0.005 a0.044±0.019 a0±0 b100.045±0.017 a0.056±0.014 a0.044±0.005 a0±0 b110.046±0.022 a0.060±0.012 a0.053±0.004 a0±0 b120.057±0.021 a0.061±0.005 a0.073±0.010 a0±0 b130.070±0.028 a0.078±0.016 a0.076±0.015 a0±0 b140.055±0.013 a0.057±0.009 a0.053±0.003 a0±0 b

表中数据为平均值±标准误，同行数据后无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05，Tukey’s HSD)。下同。

The date in the table were mean±SE. Date in the same line followed by different lowercase letters indicated the significant difference (P<0.05). The data was compared using a Tukey’s HSD test. The same as below.

图2 饲喂转基因玉米双抗12-5花粉第7天和第14天蜜蜂体内Cry1Ab蛋白平均含量Fig.2 The mean concentrations of Cry1Ab protein in the bees after feeding on DR 12-5 pollen for 7 days and 14 days

2.2.1 意大利蜜蜂的存活情况

喂食300 mg·L-1吡虫啉蔗糖溶液的蜜蜂在4 d内全部死亡(图3)。用BSA(8 μg·mL-1)，Cry1Ab(8 μg·mL-1)和纯蔗糖的蔗糖溶液喂食蜜蜂，各处理间存活率没有显著差异(Fisher检验；P=0.925>0.05)。结果表明，8 μg·mL-1的Cry1Ab对蜜蜂的存活率没有显著影响。

图3 饲喂蔗糖、BSA、Cry1Ab和吡虫啉蔗糖溶液后意大利蜜蜂生存分析Fig.3 Survival of Apis mellifera worker adults， after exposure to Cry1Ab， BSA or imidacloprid

2.2.2 意大利蜜蜂的取食情况

饲喂蜜蜂蔗糖、BSA(8 μg·mL-1)和Cry1Ab(8 μg·mL-1)第14天时，取食量情况为蔗糖组最多，BSA次之，Cry1Ab处理组略少于其他两组，各组间取食量没有显著差异(ANOVA；df=2，P=0.51>0.05)。饲喂300 mg·L-1吡虫啉取食量显著低于其他处理组(ANOVA；df=3，P=0.00<0.05)(表2)。

2.2.3 蜜蜂对Cry1Ab的摄取

Cry1Ab (8 μg·mL-1)饲喂蜜蜂第7和14天时，Cry1Ab蛋白组平均每头蜜蜂体内的蛋白含量为20.411和18.751 μg·g-1(图4)。

3 讨论

评价转基因植物对非靶标节肢动物的影响是转基因植物环境安全评价的重要内容，通常根据非靶标节肢动物暴露途径采用相应的植物组织

表2 饲喂蔗糖溶液、BSA、Cry1Ab或吡虫啉后意大利蜜蜂日取食量

Table2Mean daily consumption ofApismelliferduring 14-d chronic exposure to sucrose solution， Cry1Ab， BSA or imidacloprid

时间Time/d蜜蜂日平均取食量Daily consumptions of Apis mellifera/g蔗糖Sucrose8 μg·mL-1 BSA8 μg·mL-1 Cry1Ab300 mg·L-1吡虫啉Imidacloprid10.111±0.003 a0.112±0.001 a0.110±0.003 a0.122±0.038 a20.108±0.005 a0.093±0.017 a0.087±0.012 a0±0 b30.101±0.012 a0.100±0.009 a0.059±0.050 a0±0 b40.095±0.012 a0.098±0.013 a0.089±0.014 a0±0 b50.094±0.010 a0.086±0.007 a0.098±0.009 a0±0 b60.085±0.009 a0.096±0.010 a0.104±0.072 a0±0 b70.108±0.013 a0.106±0.003 a0.090±0.011 a0±0 b80.114±0.002 a0.104±0.002 a0.089±0.004 a0±0 b90.097±0.011 a0.090±0.006 a0.093±0.008 a0±0 b100.099±0.009 a0.092±0.005 a0.090±0.002 a0±0 b110.080±0.035 a0.086±0.01 a0.083±0.004 a0±0 b120.116±0.025 a0.091±0.014 a0.090±0.010 a0±0 b130.079±0.014 a0.082±0.010 a0.071±0.005 a0±0 b140.094±0.017 a0.087±0.011 a0.078±0.006 a0±0 b

图4 饲喂8 μg·mL-1Cry1Ab第7和14天时蜜蜂体内Cry1Ab蛋白含量Fig.4 Content of Cry1Ab in the bees after exposed to 8 μg·mL-1 Cry1Ab for 7 days and 14 days.

织或者将外源蛋白掺入饲料中饲喂受试生物从而进行评价。前者根据评价对象的取食方式选择相应的植物组织，能比较准确地反映自然条件下的暴露情况，如蜜蜂作为花粉采集和取食者，花粉是其直接暴露于Bt蛋白的主要途径，在大多数关于蜜蜂的安全评价试验中，花粉试验是主要试验方法。本研究显示，采用转基因玉米双抗12-5花粉喂食意大利蜜蜂工蜂成虫第14天对其存活率和取食量没有显著影响，而吡虫啉处理组的蜜蜂在4 d内全部死亡。蜜蜂取食转基因玉米双抗12-5花粉后，在其体内能检测到Cry1Ab蛋白的存在，喂食第7和14天的检测结果显示，蜜蜂体内Cry1Ab蛋白含量比较稳定。蜜蜂的取食量能直接反映蜜蜂的活性及整个蜂群的情况，花粉试验中转基因玉米双抗12-5花粉处理和非转基因对照玉米花粉处理对蜜蜂的取食量无显著影响。这一结果与先前针对其他转化体的研究结果一致[8，10，13，18-20]。

采用高剂量、具有生物活性的外源蛋白掺入受试生物饲料中进行饲喂试验是非靶标节肢动物安全评价的另一重要手段，这一方法能增加受试生物的暴露浓度，通过模拟高于受试生物最坏条件下的暴露水平，增加了评价的严谨性[21]。花粉试验中经ELISA检测转基因玉米双抗12-5花粉中Cry1Ab表达量为11.212 μg·g-1，每只工蜂取食6.5 mg花粉进行饲喂[22-23]，每重复取食约728.78 ng Cry1Ab蛋白，1 mL的8 μg·mL-1的Cry1Ab溶液中Cry1Ab含量为8 000 ng，浓度高于10倍花粉中Cry1Ab蛋白含量。我们在试验中采用了喂食Bt蛋白的方法。由于转基因玉米双抗12-5表达的外源蛋白为Cry1Ab/Cry2Aj融合蛋白，其杀虫活性、杀虫谱与Cry1Ab蛋白性质非常相似，因此本实验采用8 μg·mL-1的Cry1Ab蛋白掺入蔗糖水中对蜜蜂进行饲喂，这一浓度高于双抗12-5花粉中表达的蛋白浓度的10倍以上。结果显示，取食8 μg·mL-1Cry1Ab对蜜蜂工蜂成虫存活率和取食量没有显著影响，喂食第7和14天蜜蜂体内外源蛋白含量检测结果分别为20.411和18.751 μg·g-1，高于花粉试验中检测到的蛋白水平(0.747和0.735 μg·g-1)，说明当蜜蜂暴露的蛋白浓度增加时，其摄取的蛋白量也增加。在蛋白试验中，蜜蜂每日的取食量在各处理间没有显著差异，并且蜜蜂取食量在试验前期与后期变化不大，这与花粉试验中后期蜜蜂取食量下降有所不同。

蜜蜂因其重要的生态和经济意义，一直是研究转基因植物环境安全评价的最重要的非靶标生物。Duan等[7]对25种转基因植物或其表达的Bt蛋白对意大利蜜蜂的影响进行了系统分析，结果显示，转Bt基因植物或其表达的Cry蛋白如Cry1A、Cry1F、Cry1Ba、Cry2A、Cry3A、Cry3B、Cry9C对蜜蜂成虫或幼虫无显著影响。Dai等[12，24]的研究显示，Cry1Ah、Cry1Ie对中华蜜蜂和意大利蜜蜂无显著不利影响。Wang等[25]报道了表达Cry2A或Cry1C的转基因水稻对意大利蜜蜂风险较低。本研究首次报道了转基因玉米双抗12-5对蜜蜂工蜂成虫的潜在影响，研究结果与其他转Bt基因植物的评价结果一致，再次证明了转Bt基因植物对蜜蜂的安全风险较低，为转基因玉米双抗12-5的环境安全评价提供了理论依据。