银杏黄酮对缺氧复氧心肌H9c2细胞损伤的保护作用及其机制

高 阳，康 凯，王 慧

(哈尔滨医科大学第一附属医院 重症监护室，黑龙江 哈尔滨 150001)

心肌缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，涉及心肌细胞凋亡、氧化应激、炎症反应多个环节[1]。心肌缺血时诱发氧化应激反应，脂质过氧化产物及炎性因子释放增加，破坏心肌细胞正常生理功能，加重心脏组织损伤[2]。银杏黄酮(ginkgo biloba)系中药银杏叶的活性成分，具有抗炎、抗氧化、扩张血管、抑制血小板聚集等药理作用，此外，银杏黄酮对缺血再灌注心肌具有保护作用[3-5]。本实验以H9c2细胞为研究对象，采用缺氧/复氧处理模拟在体心肌缺血再灌注损伤，研究银杏黄酮对H9c2细胞的保护作用及机制，为其临床应用提供科学的实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料 银杏黄酮(批号：8310469，购自深圳市思美泉生物科技有限公司)；H9c2细胞(中科院上海细胞库)；DMEM培养基(北京索莱宝科技有限公司)；CCK8试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒、丙二醛(malondialedhyde，MDA)活性检测试剂盒(南京建成生物试剂公司)；Hoechst 染色试剂盒(上海碧云天公司)；FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；Bcl-2及Bax抗体(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 缺氧复氧模型的建立及细胞分组 共分4组，每组5个复孔。①对照组：H9c2细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，3～5 d换液1次。②实验组(缺氧复氧心肌细胞模型)：H9c2细胞置37 ℃培养罐中，缓慢持续通入含有5% CO2+95%N2的混合气体，至罐内氧气含量低于1%，造成H9c2细胞的缺氧，密封培养罐4 h后，把原来的培养液吸除，重新更换培养液，立即将H9c2细胞移至37 ℃、5%CO2的培养箱中继续培养12 h，使细胞复氧。③银杏黄酮低、高浓度组进行缺氧/复氧操作前0.5 h，在培养基中加入溶于DMSO的银杏黄酮(1、10 μg/ml)，其余步骤及同实验组。

1.2.2 CCK 8法测定H9c2细胞增殖 H9c2细胞培养于96孔板内，每孔200 μL，细胞密度为1×105/mL，弃去原有培养液，将已配置含10%CCK8的培养基以换液的形式加入，接种后的96孔板37℃培养箱中培养4h，观察细胞已贴壁。用480 nm吸光度进行检测。

1.2.3 各组细胞上清液 LDH 及细胞内SOD、MDA 检测 收集H9c2细胞上清液，严格按照 LDH试剂盒说明书检测各组细胞上清液LDH活性；另取各组细胞，裂解后按照 SOD、MDA试剂盒的方法进行各样本吸光度值检测。

1.2.4 细胞凋亡的形态学观察 我们采用Hoechst染色法定量观察细胞凋亡情况，细胞接种于6孔板中，调整细胞密度至3×105/mL，按照试剂盒说明，更换细胞培养液并用PBS冲洗3遍，在150 μL 的Binding Buffer中分别加入Hoechst(5 μL)，室温避光反应5 min，荧光显微镜下观查并拍照并统计分析凋亡细胞比例。

1.2.5 透射电子显微镜观察H9c2细胞超微结构 H9c2细胞固定于2.5%戊二醛溶液中，4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗2次后四氧化锇(1%)后固定，梯度脱水包埋，做超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色5 min，透射电子显微镜下观察细胞超微结构改变。

1.2.6 Western Blot检测Bcl-2及Bax的蛋白表达水平 收集细胞冰上加入400 μL含有蛋白酶抑制剂的裂解液研磨30 min以提取蛋白，10 000 rpm离心10 min后取上清，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后5%的脱脂奶粉4℃封闭2 h，加一抗(稀释浓度1∶1 000)过夜，室温下孵育二抗(稀释浓度1∶2 000 )1 h，ECL化学发光法自显影并采集图像。利用样本目的蛋白的光密度比内参条带的光密度，比较不同样本的相对表达率。

2 结果

2.1 银杏黄酮浓度依赖性的提高H9c2细胞存活率 实验组H9c2细胞存活率为(31.37±3.51)%，与对照组(98.66±4.50)%比较差异具有统计学意义(P<0.05)。低、高浓度银杏黄酮处理后，H9c2细胞存活率逐渐提高，分别为(54.80±4.27)%和(68.04±6.85)%，与实验组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 银杏黄酮对缺氧/复氧H9c2细胞LDH、SOD活性和MDA水平的影响 如表1所示，与对照组相比，实验组细胞外培养基中LDH的释放显著增加(P<0.05)。与实验组相比，银杏黄酮能够显著降低缺氧/复氧H9c2细胞外上清液中LDH水平(P<0.05)，说明银杏黄酮能缓解细胞损伤。与对照组比较，实验组H9c2细胞内SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；与实验组比较，银杏黄酮组能显著升高SOD活力，降低MDA水平(P<0.05)，且呈剂量依赖性。

表1银杏黄酮对缺氧/复氧H9c2细胞LDH、SOD和MDA的影响

组别LDH(U/L)SOD(U/g)MDA(nmol/mg)对照3.16±1.22167.09±4.431.43±1.85实验26.08±1.35∗108.28±5.13∗8.24±2.37∗银杏黄酮低浓度17.74±1.53#127.53±4.17#5.75±2.64#银杏黄酮高浓度8.59±1.55#143.11±3.63#3.79±2.00#

*：与对照组比较，P<0.05；#：与实验组比较，P<0.05。

2.3 银杏黄酮对H9c2细胞凋亡的影响 荧光显微镜下，对照组未见明显凋亡细胞，细胞核均为暗蓝色低荧光；实验组细胞核着色不均匀，凋亡细胞呈亮蓝色高荧光；银杏黄酮处理后凋亡细胞数量逐渐减少(见图1)；各组细胞的调亡情况见表2。

A：对照组；B：实验组；C：银杏黄酮低浓度组；D：银杏黄酮高浓度组。图1 Hoechst染色观察H9c2细胞凋亡

表2各组细胞凋亡率

组别细胞凋亡率(%)对照4.57±2.34实验69.09±5.31 ∗银杏黄酮低浓度45.88±5.53 #银杏黄酮高浓度23.63±4.27 #

*：与对照组比较，P<0.05； #：与实验组比较，P<0.05。

2.4 各组细胞超微结构改变 对照组H9c2细胞核形态正常，核膜连续，细胞核染色质分布均匀；实验组H9c2细胞肿胀，可观察到空泡样结构(自噬溶酶体水解其内容物后的产物)线粒体肿胀；低、高浓度银杏黄酮处理后，H9c2细胞形态逐渐改善，线粒体、溶酶体等细胞器逐渐恢复正常形态(见图2)。

A：对照组；B：实验组；C：银杏黄酮低浓度组；D:银杏黄酮高浓度组；放大倍数×10000。图2 电镜观察H9c2细胞改变

2.5 银杏黄酮干预促进Bcl-2蛋白表达并降低Bax蛋白表达 Bcl-2蛋白在实验组中的表达明显降低，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；低、高浓度银杏黄酮组Bcl-2蛋白表达逐渐升高，与实验组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；Bax蛋白在实验组中的表达明显升高，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；银杏黄酮干预可降低Bax蛋白的表达，低、高剂量银杏黄酮组Bax蛋白的相对表达量与实验病组相比差异有统计学意义(P<0.05，见图3，表3)。

A：对照组；B：实验组；C：银杏黄酮低浓度组；D:银杏黄酮高浓度组。图3 银杏黄酮对H9c2细胞内Bcl-2及Bax表达的影响

组别Bcl-2Bax对照1.63±0.540.21±0.06实验0.56±0.35 ∗0.89±0.11 ∗银杏黄酮低浓度0.80±0.16 # 0.52±0.10 # 银杏黄酮高浓度1.22±0.18 #0.30±0.12 #

*：与对照组比较，P<0.05； #：与实验组比较，P<0.05。

3 讨论

多种心血管疾病的损伤机制与心肌细胞的缺氧复氧损伤密切相关[6]。心肌细胞复氧后在黄嘌呤氧化酶的作用下大量活性氧族(ROS) 堆积，导致内皮细胞功能障碍，进一步促进ROS的生成[7-8]。本实验模拟心肌缺氧再灌注损伤，体外培养H9c2细胞并制备缺氧/复氧损伤模型，以期进一步探讨该药物对H9c2细胞的保护作用。我们的研究结果显示，缺氧/复氧破坏了H9c2细胞正常生理功能，细胞存活率明显下降。

临床上，银杏黄酮已被用于辅助治疗心肌缺血再灌注损伤[9]。研究显示，银杏黄酮通过扩张心肌血管改善微循环、恢复缺血病变区血流量，有利于心脏功能复原和改善；此外，银杏黄酮还可减轻心脏血管损伤和炎症反应，从而减少缺血缺氧对心脏功能的损伤，对心肌缺血再灌注损伤疾病有较好疗效[10]。

关于银杏黄酮对H9c2细胞缺氧复氧损伤保护作用的研究不多，国内学者徐露通过制备大鼠心脏缺血再灌损伤模型，在体观察银杏黄酮对大鼠心肌保护作用，证实银杏黄酮可改善大鼠心律失常，对抗大鼠心脏缺血再灌损伤并降低Cx43异常表达[11]。

心肌细胞氧化功能破坏产生大量ROS。银杏黄酮预处理能显著降低缺氧复氧H9c2细胞外上清液中LDH漏出率，增加缺氧复氧H9c2细胞内SOD的表达，降低细胞内MDA含量，说明银杏黄酮能够有效缓解细胞损伤。

Hoechst 染色剂能透过细胞胞膜并嵌入细胞核DNA，使其发出明亮的蓝色荧光。凋亡的细胞核浓染，荧光增强，呈致密颗粒和(或)块状高荧光。本实验中，实验组中亮蓝色荧光显著增加，证实缺氧复氧可诱导H9c2细胞凋亡，银杏黄酮低剂量组及银杏黄酮高剂量组中凋亡细胞比例逐渐下降。

心肌缺血再灌注导致的细胞损伤通过细胞凋亡方式最终导致心肌细胞死亡。Bcl-2在氧化应激介导的细胞凋亡反应中起重要作用，具有潜在的抗凋亡作用[12]。Bax表达水平的高低直接反应细胞凋亡程度，Western blot结果显示，实验组细胞中Bcl-2蛋白表达明显降低，Bax蛋白表达明显增加，提示缺氧复氧诱导了心肌细胞凋亡，银杏黄酮通过改变Bcl-2、Bax蛋白的表达发挥抗细胞凋亡作用，增强损伤心肌组织对缺血、缺氧的耐受。

综上所述，银杏黄酮能够有效抑制缺氧复氧诱导的H9c2细胞凋亡，因此我们推测，银杏黄酮在预防和治疗心肌缺血再灌注损伤疾病方面具有一定的应用前景。