杉木提取物凝胶剂修复大鼠皮肤创面的效果研究

李沅衡，苏 欢，蔡思琪，卢 巍，莫镇涛，蒋振东，刘 宁，杨 琳

(1.遵义医科大学珠海校区 人体解剖与组织胚胎学教研室，广东 珠海 519000；2.遵义医科大学珠海校区 药理学教研室，广东 珠海 519000；3.遵义医科大学珠海校区 护理学教研室，广东 珠海 519000)

创面愈合是各种致伤原因造成组织损伤后依赖机体再生及修复功能完全或部分恢复相应结构及功能的过程[1]。随着糖尿病等慢性疾病发病率的不断增长，机体自身创面愈合能力及愈合速度均有所下降，皮肤作为人体最大的器官是机体重要保护防线，当其出现损伤或缺失时不及时予以治疗措施可能导致瘢痕愈合甚至感染，严重影响皮肤正常结构及功能[2-4]。莫匹罗星是临床上治疗皮肤破损感染最常见的药物之一，但随着抗生素的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)类创面耐药菌感染已成为阻碍创面愈合最主要的原因之一[5]。杉木是我国南方重要造林树种，其作为优良的速生用材树种，材质轻柔、结构匀称、耐腐性强[6]。民间有报道使用杉木碎屑外敷急性创伤伤口，具有快速止血和收敛伤口作用，并可用于治疗跌打损伤、过敏性皮炎等[7]。相关研究显示，杉木提取物对多种病原微生物有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌等[8]有较强的抑制作用。因此，杉木提取物在临床外用辅助创面修复有着一定的临床价值，但相关报道研究较少[9]。本研究将杉木提取物与药用辅料卡波姆有效地结合成凝胶剂，通过比较不同浓度杉木及莫匹罗星对SD大鼠皮肤创面愈合能力的影响，探究杉木提取物凝胶对创面修复治疗的优势，为临床利用杉木提取物辅助创面修复提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及菌种 SD大鼠32只，雌雄各半，体重200g±20g，购自广东省实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(粤)2013-0002，饲养于普通级动物房内，温度(22±2)℃，相对湿度40%～60%，12 h光照、12 h避光循环饲养。金黄色葡萄球菌购自上海鲁微科技有限公司，菌种编号CMCC(B)26003、大肠埃希菌购自上海鲁微科技有限公司，菌种编号ATCC25922。本实验动物处理方法符合动物伦理学标准， 并经遵义医科大学实验动物伦理委员会审批。

1.2 实验仪器 旋转蒸发仪(HeidolphHei-VAP，Precision，德国)；自动脱水机(ASP300S，Leica，德国)；自动包埋机(TB-718E，Leica，德国)；石蜡切片机(RM2255，Leica，德国)；光学显微镜(6BX43，Olympus，日本)；电动搅拌机、真空泵、回流冷凝装置各一套。

1.3 实验试剂 杉木干(取自贵州省毕节市)；无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)；卡波姆940(上海麦克林生化科技有限公司)；HE试剂盒(北京雷根生物有限公司)；甘油(国药集团化学试剂有限公司)；苯甲酸钠(天津市大茂化学试剂厂)；三乙醇胺(天津市大茂化学试剂厂)；二甲苯(广东光华科技股份有限公司)；HE染料(北京雷根生物有限公司)；莫匹罗星软膏(上海景宏生物科技有限公司)；营养肉汤(广东环凯微生物有限公司)；琼脂粉(广东环凯微生物有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 杉木原液提取 将杉木的芯材置于干燥箱中，在105 ℃下烘至恒重后，用刨片机刨成薄片待用。称取薄片置于圆底烧瓶中，用75%乙醇浸泡3 h后，利用真空旋转蒸发仪进行浓缩提取。按照料液比1∶5(g/mL)旋转蒸发3 h后，得到浓缩液体，分装后置于4 ℃冰箱中待用。

1.4.2 杉木凝胶剂制备 称取0.75g卡波姆(型号940)于25g甘油中充分浸润研磨，待溶胀后，分别量取杉木提取物浓缩溶液20 mL和稀释一倍后同体积的浓缩液加入其中，滴加配置好的1%苯甲酸钠1 mL和15%三乙醇5 mL，充分搅拌后使其成为凝聚状，最后获得杉木提取物0.2 g/mL高剂量凝胶(原浓缩液浓度)和0.1g/ml低剂量凝胶(稀释1倍后的浓缩液浓度)，分装后置于4℃冰箱待用。

1.4.3 创面动物模型构建 采用10%水合氯醛0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉，脱毛后利用灭菌手术剪在大鼠背部脱毛区制作半径1.8 cm的机械性全层皮肤创面，面积约达10.2 cm2，创面呈圆形，达深筋膜。大鼠致伤后分笼饲养，创面制作后不做处理，待清醒后于高压灭菌垫料中单笼饲养。

1.4.4 给药方式 将造模成功的创伤大鼠随机分为4组，每组8只，给药方法分别为：阴性对照组创面不予以处理；阳性对照组创面采用莫匹罗星软膏0.1 g进行处理；低剂量组创面用杉木提取物低剂量凝胶0.1 g；高剂量组创面用杉木提取物高剂量凝胶0.1 g。涂药时将药物覆盖于创面上，每24 h给药1次，连续给药14 d。

1.4.5 抑菌试验 采用打孔器将滤纸制成6 mm小圆片，高压灭菌后分别浸泡于低剂量杉木原液、高剂量杉木原液、莫匹罗星溶液及生理盐水中各1 h，自然风干后贴附于接种细菌的培养基平板上，其中金黄色葡萄球菌平板与大肠埃希菌平板各5个，纸片贴附完成后置于37 ℃培养箱中24 h。

1.5 观察指标

1.5.1 创面愈合评估 观察大鼠在造模时及给药后，创面渗出物、感染情况、上皮覆盖、肉芽生长等，每天观察大鼠创面愈合情况，于创伤后0、3、7、14 d，使用电子游标卡尺测量创口的长轴与短轴，并计算其创面愈合率：创伤愈合率(%)=(第0天创伤面积-第n天创伤面积)/第0天创伤面积×100%。

1.5.2 组织病理学观察 伤后第14天取材，将大鼠全皮摘除并修整，用Bouin’s固定液固定24 h，依次脱色、脱水、进行石蜡包埋；常规切片3 μm厚，HE染色后中性树胶封片。显微镜观察皮肤组织形态及病理变化。

1.5.3 抑菌圈直径测量 采用电子游标卡尺测量金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌平板上各纸片抑菌圈直径。

2 结果

2.1 创面愈合的大体观察 创伤3 d后，各组创面均有减小，阳性对照组和高剂量组均有薄膜样组织生成封闭创面，低剂量组与阴性对照组创面可见炎性渗出物，周围组织伴有轻度水肿；第7天，各组创面面积较前均有缩小，可见不同程度的上皮爬生，阳性对照组创伤面积最小，高剂量组已产生干痂，低剂量组创伤面积最大，血痂下可见新鲜肉芽组织，阴性对照组创面仍可见少量炎性渗出物，色泽红润，未见明显结痂。伤后第14天，各组大鼠创面面积缩小显著，其中阳性对照组、高剂量组及低剂量组缩小最为明显，几乎痊愈，损伤皮肤周围毛发逐渐生长，阴性对照组创面仍可见，周围毛发稀疏。创面愈合大体情况详见图1。

2.2 各组创面愈合率 伤后第3天，高剂量组愈合率高于阴性对照组，低于阳性对照组，低剂量组愈合率低于阳性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；伤后第7天 高剂量组愈合率高于阴性对照组(P<0.05)，与阳性对照组比较无统计学意义(P>0.05)，低剂量组愈合率低于阳性对照组(P<0.05)，与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)；伤后第14天，高剂量组愈合率与阳性对照组差异无统计学意义(P>0.05)，但显著高于阴性对照组(P<0.05)，低剂量组愈合率明显低于阳性对照组(P<0.05)，但高于阴性对照组(P<0.05)，与治疗前比较，各组伤后第3、7、14天愈合率均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

组别伤后第3天伤后第7天伤后第14天阴性对照12.36±1.45c56.80±4.17c93.60±1.05c阳性对照26.40±2.12c65.80±4.21c97.05±0.71c高剂量14.01±1.61abc62.19±3.82ac96.28±0.80ac低剂量12.49±1.33bc54.95±4.07bc95.90±1.01abc

a：与阴性对照组比较，P<0.05；b：与阳性对照组比较，P<0.05；c：与治疗前比较，P<0.05。

2.3 组织病理学表现 大鼠伤后14 d创面修复情况，各组大鼠创面皮肤已被肉芽组织填满、表皮完全覆盖伤口表面。阴性对照组中肉芽组织增生明显，成纤维细胞排列整齐，局部可见少量炎性细胞浸润；阳性对照组和高剂量组肉芽增生与对照组相比基本相近，成纤维细胞排列较整齐，局部可见炎性细胞浸润；低剂量组中，肉芽组织增生与前三组比相对较少，成纤维细胞排列稍散乱，局部可见炎性细胞，见图2。

2.4 抑菌圈直径 高剂量与低剂量杉木在金黄色葡萄球菌平板中抑菌圈直径大于生理盐水，小于莫匹罗星，差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量杉木在大肠埃希菌平板中抑菌圈直径大于生理盐水，小于莫匹罗星，差异有统计学意义(P<0.05)，低剂量杉木在大肠埃希菌平板中抑菌圈直径与生理盐水无显著差异(P>0.05)，却明显小于莫匹罗星(P<0.05)，见表2。

A：阴性对照组；B：阳性对照组；C：高剂量组；D：低剂量组；蓝色箭头表示肉芽组织增生；黄色箭头表示炎性细胞浸润；H E染色，×20。图2 造模后第14天大鼠背部皮肤切片观察结果

组别金黄色葡萄球菌大肠埃希菌生理盐水6.13±0.096.15±0.06莫匹罗星29.84±3.169.19±1.17高剂量杉木18.43±2.02ab7.14±0.33ab低剂量杉木12.36±1.86ab6.85±0.21b

a：与阴性对照组比较，P<0.05；b：与阳性对照组比较，P<0.05。

3 讨论

近年来，在自然界中发现了许多能辅助创面愈合的抗菌物质，这些植物源的抗菌物质不但能有效的控制创面感染，改善创面部位的血液循环，同时还具有抗炎和一定的镇痛作用[10-13]。杉木作为我国的特有树种，是南方地区的重要造林树种，其药用价值受到了研究学者们的重视。《全国中草药汇编》中表明杉木性辛微温，具有祛风止痛、散瘀止血，防腐生肌的功效。现代医学表明，皮肤创面愈合过程是一种局部炎症反应，损伤后48h内，巨噬细胞及中性粒细胞参与炎症反应，表现为组织变性、坏死以及异物清除，增殖期损伤部位成纤维细胞大量增殖并分泌丰富的细胞外基质，表皮细胞迁移、增殖、分化，新生毛细血管丰富，重塑期形成肉芽组织，且逐渐向瘢痕组织转化重新覆盖创面[14-15]。杉木芯材主要有效成分为柏木脑、α-杜松醇，相关研究表明该物质可作为一种镇痛抗炎药物用于关节炎治疗[16]。据文献报道，杉木的组成成分及活性特点已经有了较为深入的研究，相关实验表明其芯材的精油和提取物均有较强抗菌效果[17]。

本研究通过已有方法[9]提取杉木芯材提取物，结合新型水性凝胶基质——卡波姆，将其制作成外用药物。由于卡波姆具有较好的生物黏滞性、更长的药物缓释时间及保湿性等特点，药物载入后可以进一步提高疗效，因此在医疗卫生领域得到了广泛的应用[18-19]。莫匹罗星是临床常用的治疗创伤药物，可促进创伤部位中性粒细胞及巨噬细胞聚集，刺激毛细血管新生，利于创面愈合，同时对以金黄色葡萄糖球菌为主的革兰阳性球菌抑制作用明显，在临床上常作为烧伤类及溃疡类皮肤损伤性疾病的主要治疗药物之一，因此本实验将其作为分析杉木凝胶创伤愈合效果的阳性对照[20-21]。

结果表明，伤后3～7d即炎症反应期，阳性对照组和高剂量组愈合效果均显著；伤后第7～14天即肉芽组织生成期，阳性对照组和高剂量组创面愈合面积均增幅显著，这是由于在炎症反应后期，创面的炎性反应得到了控制，新生的肉芽组织获得了较好的生长条件；伤后14d即皮肤重塑期，宏观上，各创面均已基本上皮化，对照组其创面伤口也会自行进行相关的组织修复，促进伤口愈合。微观上，组织学结果发现，大鼠的创面均已充填肉芽组织，炎性细胞局限化，但成纤维细胞排列存在有不同程度的差异。与对照组相比，阳性对照组和高剂量组均呈现较理想的结果，而阳性对照组最为显著。低剂量组内细胞排列散乱，细胞增生数量较对照组明显较少。因此，利用外用药物干预创面愈合的意义在于控制炎性反应和肉芽组织的新生，减少创面发生感染的概率，促进创面的愈合。

分析抑菌试验结果发现，杉木原液对金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌具有一定的抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌抑制作用明显强于大肠埃希菌，浓度越高，抑菌效果越好。皮肤创面损伤优势菌感染以金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌为主，金黄色葡萄球菌可分泌大量神经鞘磷脂酶、葡萄糖磷脂酶、丝氨酸蛋白酶等多种酶类物质，神经鞘磷脂酶、葡萄糖磷脂酶可损伤皮肤角质层细胞间脂质正常结构和功能，导致皮肤重塑过程受阻，创伤破坏皮肤正常屏障功能使局部pH升高，引起丝氨酸蛋白酶活化反应，造成角桥粒分解，角质层结构难以重建，进一步抑制损伤皮肤的愈合[22-23]。大肠埃希菌作为一种机会致病菌，在皮损愈合过程中亦会抑制组织修复，导致创面愈合缓慢。杉木原液通过抑制金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌定植，避免伤口感染，促进创面愈合，对治疗皮肤创面具有良好治疗价值[24]。

综上所述，杉木提取物凝胶剂在外用抗感染及抑菌实验中均表现出了较强的抑菌效果，通过控制炎症反应以降低创面感染的发生率，从而加速新生肉芽组织的形成以达到创面修复组织的作用。