学科跨界：现代再生生物医学与植物构架研究

李文娟，王李阳

（陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710119）

1 前言

将器官或组织工程学应用于人体以解决器官组织的再生问题，是现今生物工程领域一个重要的研究方向。首先在体外构建器官或组织，而后将其移植到体内替代因疾病衰竭或意外损坏而导致坏死的器官，整个过程大多具有非侵入性，即在不对生物体实施侵犯性策略时，就可实施替代。这种技术很大程度上克服了供体不足的局限性，极有可能在根本上解决器官移植的重大问题。自干细胞应用于生物工程领域以来，组织工程已取得了很大的突破，比如再生皮肤、人造骨骼、气管等的出现。

器官移植供体的传统来源为自体移植或者近亲在血型匹配下供给，供体数量严重不足。20世纪90年代初，英国剑桥大学首次尝试猪-人异种器官移植。猪器官与人器官在尺寸大小、生理特性和代谢功能上均相似，但猪器官作为移植器官仍有免疫排斥性，人体将其作为异物加以识别、确认和排斥。2016年，哈佛大学计划使用CRISPER-CAS9技术将猪和人免疫不匹配的45个相关基因进行改造，以得到不被人类免疫系统排斥的体外器官。然而，该过程复杂且不可预见性强，到目前为止尚未彻底解决异种移植免疫相斥性的问题。

受体对移植物的免疫排斥性问题不仅是器官和组织移植医学领域的重要问题，同时也是器官或组织工程学的重要问题。2018年，动物植物跨界交叉应用于组织工程学研究。该研究进展基于植物对动物和人体的低免疫源性，其运用使生物工程获得了突破，这种极强的组织兼容性使器官或组织生物工程进入一个实用性时期。本文对近年来动植物跨界交叉应用于组织工程学领域的研究进展、工程模式和应用优势进行了较为详尽的归纳，对该跨界交叉应用过程亟待解决的问题进行了总结，并对未来生物医学应用的可能性进行了阐述。

2 器官组织工程的特点

器官组织工程学是一门紧密结合诸如干细胞再生生物学、纳米技术的极具生命力的新兴学科，学科初建显示了强有力的发展趋势。学科目标明确，基本原理简明，具体原理为：①建立器官或组织（organ/tissue，O/T）构架（Scaffold）；②在此构架上种植细胞，最终形成再生器官或组织。种植的细胞的种类有体细胞和干细胞两类，由于体细胞来源于已经成熟的组织，其逐渐被多功能干细胞所替代。干细胞在这个O/T构架提供的3D环境和其生长和分化信号诱导下，粘附、增殖、迁移和分化，形成再生的器官或组织。O/T构架用于提供未来组织的机械支持和传递细胞信息能量，控制再生组织的形状和大小以及呈现具有时空准确性的物理和化学分子信号，最终促进干细胞增殖和分化。

器官组织工程O/T构架主要为多糖/糖蛋白的材料或脱细胞的天然生物材料，其中细胞外基质为其主要成分。O/T构架主要分为两类：①基于多糖/糖蛋白的天然材料与合成聚合材料的混合材料。通常，天然材料机械性较差，合成聚合物生物材料有着优良的可加工性和结构力学特征，但有潜在毒性，易引起炎症反应，混合材料有效地将两者的优点结合起来。②脱细胞的天然生物材料。这种O/T构架由于一定程度上保持了细胞外基质构架的完整性，因而不需要额外处理或修饰便可提供干细胞生长分化需要的营养成分和时空调控因子，这从结构上有效地解决了构架供血不足的问题，因而脱细胞O/T构架也是一种预血管化生物活性构架（Scaffold）。

3 器官组织工程的重要突破和亟待解决的问题

器官组织构建主要有两种方式，即在体（in vivo）器官组织的和体外（in vitro）器官组织的再生体系，然而这两种体系都面临组织兼容性的问题，组织兼容性是目前器官组织构建不可回避的科学问题。

3.1 在体器官组织的再生体系

目前，我国在在体器官组织的再生领域已取得引人注目的成就。2016年，曹谊林课题组成功在哺乳动物体内植入抗骨癌构架。将阿霉素（ADM）混到多孔纳米羟基磷灰石/胶原蛋白构架中（ADM-PLGA-NHAC）后，对其在大鼠中进行免疫应答测试，在兔中评估骨修复能力和在裸鼠内检测抗肿瘤功效。实验证明，该构架有着优秀的生物兼容性，ADM的存在并未影响NHAC突出的骨修复能力。

ADM-PLGA-NHAC在肿瘤中的植入相较于直接往腹膜内注射ADM，改善了抗肿瘤效果并减少了不良副作用。构架具有优异的缓释药性、骨修复和抗肿瘤功效，这使其成为有前景的抑制骨瘤的骨传导性材料。在国际同行中，2018年，MIT的Langer课题组首次在灵长类绿猴中测试了一种多孔可降解生物兼容性构架对脊髓损伤的修复作用，其植入明显改善了脊髓受损绿猴的运动能力。实验证实此构架在灵长类脊椎损伤治疗中具有安全性和功效性，为进一步用于临床治疗急性脊髓损伤提供实验基础。

3.2 体外组织的再生体系

2012年，干细胞研究成果获得了诺贝尔医学奖，随后多功能干细胞的引入使得器官组织工程进入到发展的重要阶段。干细胞可在构架提供的合适的体外环境下，诱导分化形成各类细胞，最终构建出器官。体外组织的再生体系具有重现器官发育的潜力，而且可以互作于细胞微环境，因而在疾病体外模拟、药物测试和组织工程等领域有极大的发展前景。在最佳的构架环境下，人多能干细胞可衍生出几乎所有器官的类器官，如肠道、肾脏等，甚至包括大脑和视网膜，而且整个过程与体内器官的发生过程相似。体外器官发生方法对每个器官都是特定的，通常是使用特定的生长因子或者不同的营养组合来驱动获得器官前体，而后体外培养的干细胞会经过细胞分选和干细胞的谱系提交和调控产生出器官内的各类细胞。2016年，日本RIKEN中心在体外将人类胚胎干细胞诱导形成hESC视网膜组织，经检测该移植物可以在体内存活并成熟，且移植物与宿主细胞之间有突触连接形成，说明这种体外诱导的hESC视网膜具有一定的临床效用。植物细胞也可在构架上生长，模拟出天然的生长状态。2015年，剑桥大学研究小组将拟南芥和百叶草等细胞，种植于人体组织工程中使用的生物兼容性Shear-spun纳米微纤维构架上，开发出一种植物细胞3D培养方法，可以模拟植物组织环境。这种在微观尺度下探索植物细胞与环境相互作用的新技术，将为以后研究提供一种新的植物细胞培育方案。

3.3 解决器官移植受体对植入组织排斥性的现行对应方案

无论是在体器官组织的再生体系还是体外组织的再生体系，器官组织工程现行的研究阶段还是未来的临床应用，面临最重大的问题都是受体对移植物的组织排斥性。哈佛大学的Church团队使用CRISPR-cas9编辑技术破坏了猪源上皮细胞系中所有的PERV，该技术为异种器官移植中免疫排斥性和PERV的感染问题提供了解决途径，从而克服人类器官移植供体不足的问题，但使用CRISPR-cas9技术将猪的基因改造成类似于人类的基因，不仅技术上相当烦琐，且仍不能完全解决异源移植中组织排斥性的问题。

4 植物构架应用于动物器官组织再建的特色

4.1 植物构架与动物性构架的特性比较

植物构架应用于动物器官组织工程在保持了传统构架特点的同时，凸现出许多动物性构架不具备的优点。从共同特性上来看，主要有：①植物构架保持了一些动物蛋白材料和多糖材料以及脱细胞材料的特点，植物蛋白或多糖材料不仅保持了与动物材料相类似的物理化学特性，易于构建成各种形状和大小的构架，并可提供3D环境供干细胞生长和分化；②植物脱细胞构架中的叶脉系统与动物组织中的脉管系统类似可进行营养物质的输送，与动物脱细胞构架类似；③植物的基因修饰的可操作性，使得植物构架与最新的科研成果如纳米3D热点技术、干细胞、CRISPR基因编辑、药物筛选等有效地结合起来。

从独特性质的优点来看，植物构架确实具有动物构架不具有的特点：①植物构架对器官组织的移植受体没有或有明显较低免疫排斥性，与构建细胞组织兼容性强，从而有可能彻底解决器官移植的免疫排斥性；②植物构架低成本，供体数量无局限，无时间限制；③植物构架有更高的极性，其亲水性更优，更利于种子细胞的粘附生长；④植物构架操作简单，易于投入大规模的研究，特别在基础研究阶段，有利于获取具有临床适用性的研究成果；⑤现代基因修饰技术暂无社会伦理的阻碍。使用转基因植物生产人类蛋白用于构建更加利于细胞生长的构架，植物源人重组胶原蛋白在组织工程中应用，可在保持构架优异性能的前提下降低过敏和疾病传播的风险。

4.2 植物构架和动物性构架的制备方法

将来源不同的器官充分有效地脱细胞化，再种植细胞或干细胞，进而用作器官移植物，是生物医学界的一个挑战，鉴于干细胞的全能性，社会对这一领域充满希望。脱细胞构架的制备原理主要是通过物理方法或化学方法将组织或器官中的细胞去掉，以降低构架的免疫源性并保留细胞外基质成分，最后使用干细胞将构架再细胞化。由于脱细胞的不同方法会对细胞外基质的组成结构、构架力学均有影响，因而评估脱细胞方法的标准是细胞的去除率以及细胞外基质的保留率。

4.2.1 动物组织去细胞化——动物性构架的获得

由于动物性构架的使用一直是器官组织工程的经典范例，动物组织构架脱细胞化较植物组织更为成熟。2016年，哈佛医学院Ott团队采用SDS和内切核酸酶灌注-脱细胞化的方法将人类心脏脱细胞化，得到微血管保存完整的无细胞人类心脏。脱细胞后的心脏蛋白量减少了89%，细胞外基质相关蛋白显著保留，不溶性脂肪组织基质和脂质分子仍保留在心外膜表面。将其在大鼠中进行免疫生物兼容性测试发现，不同于原心脏和猪脱细胞心脏引起的M1巨噬细胞促炎反应，人脱细胞构架心脏引起的是M2巨噬细胞反应。再细胞化后，人工心脏展现了能产生力的有代谢功能的心肌组织。2017年Vranckx等使用洗涤剂-酶促脱细胞化兔气管。

4.2.2 植物组织去细胞化——植物构架的获得

植物组织去细胞化通常以两种方法获取植物构架，即使用类似清洗哺乳动物组织的去污剂方法和使用漂白剂简单的非去污剂方法。2018年Adamski团队证明，这两种方法均产生了机械性质好、对细胞代谢影响小的植物叶脉网络构架，并保留了植物叶脉天然的运输系统，营养运输能力和保水能力好，具有高表面积体积比。

植物构架具有优良的免疫相容性，已被再生生物工程研究者基本认可。2016年，Pelling团队将制备的红苹果果肉脱细胞纤维素构架植入免疫活性小鼠中，在鼠体中1周内该构架产生免疫应答，4周后构架周围的表皮组织免疫应答降低，8周后这些免疫应答完全消失，纤维素构架被宿主接受，所有小鼠均没有明显免疫性反应的症状。

5 结论与展望

近年来，器官组织工程的应用优势及与多种前沿科学如纳米技术、干细胞等领域的结合使其成为生物工程领域的一大热点。无论是在体器官或组织再生还是体外器官或组织培养，构架的特性都是组织工程中的关键问题。具有优异的力学特征的各类构架能否应用于临床决定于它的生物兼容性。合成聚合材料生物活性差、有低毒性，而动物组织材料易于引起人体的免疫反应，因而，植物组织的低免疫源性及其制备的简易性和易获得性使其成为组织工程中解决这一关键问题的重要选择。植物构架应用于动物器官组织工程在保持了传统构架特点的同时，凸显出许多动物性构架所不具备的优点。